Diese Methode kann verwendet werden, um Salmonellen aus Lebensmittelproben zu erkennen und den Erreger durch genetische Fingerabdrücke auf die Stammebene zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Salmonellen-Erkennung und Subtypisierung in einem einzigen Workflow kombiniert und die Bearbeitungszeit von salmonellaverseuchten Lebensmittelproben bis zum Fingerabdruck des Erregers erheblich verkürzt. Zunächst legen Sie aseptisch eine 25-Gramm-Probe von Lebensmitteln in einen sterilen Labormixerbeutel mit einem eingebauten Filter oder bereiten optional einen Umwelttupfer vor, indem Sie einen Schwamm mit Anreicherungsbrühe aseptisch befeuchten, ihn über eine vorbestimmte Oberfläche ziehen und in einen Mixerbeutel legen.
Mit einem Labormixer jede Probe mit 225 MilliliterRV-Anreicherungsbrühe gründlich vermischen. Dann die Mischung bei 42 Grad Celsius für vier bis 21 Stunden inkubieren. Danach eine 50-Milliliter-Unterprobe der Anreicherungsbrühe von der gefilterten Seite des Beutels sammeln.
Zentrifugieren Sie dann die Unterprobe 10 Minuten lang bei 100 mal g. Den Überstand vorsichtig auf ein neues 50 Milliliter Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge mit 3.000 bis 6.000 mal g für 10 Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in fünf Milliliter BPW.
Das Pellet in fünf Milliliter NBPW wieder aufhängen. Zuerst tauen Sie den Probenpuffer und den Reaktionspuffer aus dem MDA-Kit auf Eis auf. Legen Sie einen Milliliter resuspendierte Zellen in BPW und 20 Mikroliter Anti-Salmonella-Perlen in ein Mikrozentrifugenrohr.
Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen rotierenden Mischer. Danach stellen Sie das Rohr für drei Minuten auf einen magnetischen Ständer. Invertieren Sie das Magnetgestell mehrmals, um die Perlen in ein Pellet zu konzentrieren.
Halten Sie das Rohr auf dem magnetischen Rack, aspirieren und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie dem Rohr einen Milliliter Waschpuffer hinzu. Entfernen Sie den Rohrhalter aus dem Rack und invertieren Sie den Rohrhalter mehrmals, um nicht spezifisch bindende Bakterien aus dem Komplex zu entfernen.
Nach der dritten Wäsche den Überstand aus dem Rohr aspirieren und entsorgen. Dann entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack und zentrifugieren Sie es für eine Sekunde. Legen Sie dann das Rohr für drei Minuten auf das Magnetgestell, bevor Sie einen Restwaschpuffer entfernen.
Setzen Sie die Perlen-Salmonella-Komplexe in neun MikroliterN Probenpuffer wieder auf und brüten Sie die Röhre drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Nach dem Abkühlen der Komplexe auf Eis, fügen Sie neun Mikroliter Reaktionspuffer und einen Mikroliter Enzymmischung hinzu. Inkubieren Sie die Röhre in einem thermischen Cycler gemäß dem Textprotokoll und kühlen Sie die Röhre auf Eis.
Verwenden Sie als Nächstes ein Fluorospektrometer-Instrument, um die DNA-Konzentration und Reinheit der Probe zu messen. Bewahren Sie die Endprodukte bei negativen 20 Grad Celsius für zukünftige Experimente auf. Bereiten Sie 18 Mikroliter PCR-Mischung pro Probe gemäß dem Textprotokoll vor.
Mischen Sie dann das MDA-Produkt, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie dem PCR-Gemisch zwei Mikroliter der MDA-Produktsuspension hinzu. Führen Sie die Echtzeit-PCR mit einem optimierten Echtzeit-PCR-Protokoll entsprechend dem Textprotokoll aus.
Fügen Sie Pufferlösungen und Reagenzien zum MDA-Produkt hinzu, wie im Textprotokoll angegeben, und übertragen Sie die resultierenden 40 Mikroliter des sequenzierten MDA-Produkts auf eine neue Platte und fügen Sie jedem Bohrwert 20 Mikroliter PCR-Reinigungsperlen hinzu. Als nächstes inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann die Perlen mit 80% Ethanol waschen und 12 Minuten trocknen.
Die getrockneten Perlen in 53 MikroliterResuspensionspuffer wieder aufhängen und die Perlen bei Raumtemperatur für zwei Minuten bebrüten. Schließlich, verdünnen und Pool Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers. In diesem Protokoll wurde eine gezielte Mengenbewertung der Salmonellen-DNA durch Echtzeit-PCR durchgeführt.
Repräsentative Ergebnisse von zwei Marken der Salmonella-verseuchten Hühnerbrust reichten von 701,54 bis 945,86 Nanogramm pro Mikroliter, was darauf hindeutet, dass die Proben-DNA effektiv verstärkt wurde. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, IMS-Perlen sorgfältig zu waschen und zu behandeln, MDA-Reagenzien und Produkte frei von Verunreinigungen zu halten und eine saubere Haube zu pflegen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Lebensmittelsicherheit und der öffentlichen Gesundheit, um eine schnelle und hochauflösende Verfolgung von Salmonellenkontaminanten in Lebensmittelproben, Produktumgebungen und Lieferketten zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebensmittelbedingten Krankheitserregern extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Befolgen guter Laborpraktiken sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
