Dieses detaillierte Protokoll beschreibt eine hocheffiziente und kostengünstige Methode der bakteriellen Expression für die rekombinante MMP-3-katalytische Domäne in E.Coli, die auf andere MMP-therapeutische Ziele angewendet werden kann. E.coli fehlt ein komplexes Proteinfaltungs- und posttranslationales Verarbeitungssystem. Diese Methode verwendet den R2DP-Zellstamm, um die eukaryotische Proteinexpression in E.coli zu verbessern.
Die Überproduktion spezifischer MMPs führt zu verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen. Aktiv lösliche MMPs werden für die Entwicklung von MMP-hemmenden Therapeutika benötigt. Beimpfen Sie eine einzelne isolierte Kolonie von pET His-tag pro MMP-3 katalytischen Domänentransformanten aus einer LB-Ampicillin-chloramphenicol-resistenten Platte in fünf Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistenten Medien bei 37 Grad Celsius.
Speichern Sie Aliquots aus jeder Kultur und bereiten Sie 40% Glycerinvorräte vor. Beimpfen Sie einen Ein-Liter-Kolben mit 500 Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistentem Medium auf eine optische Dichte von 0,05 bis 0,1 bei 600 Nanometern mit der Übernachtkultur. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern zu mehreren Zeitpunkten, typischerweise für drei bis vier Stunden, bis sie zwischen 0,4 und 0,6 fällt.
Induzieren Sie die Kulturen mit einem molaren IPTG-Stamm zu einer Endkonzentration von einem Millimolaren. Im 37-Grad-Shaker weitere drei bis vier Stunden inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen in 250-Milliliter-konischen Flaschen bei 13.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten und wiederholen Sie sie, bis die Kulturen vollständig pelletiert sind.
Fügen Sie drei Milliliter Lysepuffer pro Gramm Pellet hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Vortexen oder Pipettieren. Fügen Sie 1,25 Milliliter 10% Volumengewicht Natriumdesoxycholat pro Liter Kultur hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter DNase I pro Liter Kultur hinzu.
Bei Raumtemperatur 30 Minuten bei 150 U/min schütteln. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendiert das Pellet in 100 Milliliter pro Liter Kultur des Einschlusskörperpuffers durch Pipettieren nach oben und unten. Bewahren Sie die Proben während der Beschallung auf Eis auf, um eine Überhitzung zu vermeiden. Beschallen Sie jede Probe für sechs Zyklen von 15 Sekunden, eine Ausgabe von fünf und einen Puls von 50%.
Die Proben werden 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Überprüfen Sie das Pellet. Wenn das Pellet kompakt ist, entsorgen Sie den Überstand.
Resuspendiert jedes Pellet aus einer Ein-Liter-Kultur und fünf Milliliter Solubilisierungspuffer. Inkubieren Sie mindestens 30 Minuten auf Eis, damit die Proteine auflösen können. Zentrifen Sie die Zellen für 10 Minuten bei 13.000 mal G bei vier Grad Celsius.
Wenn sich das Pellet nach der Zentrifugation bildet, gießen Sie den Überstand in ein separates konisches 50-Milliliter-Rohr. Resuspendiert das Pellet in weiteren fünf Millilitern Solubilisierungspuffer pro Liter Kultur durch Pipettieren auf und ab. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius.
Als nächstes ziehen Sie die Überstände. Entsorgen Sie das Pellet oder lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zusätzliche Beschallung. Gegen HT-Waschpuffer leeren und den A280 der ersten Waschfraktion aufzeichnen.
Wiederholen Sie dies mit anderen Brüchen, bis sich A280 dem Ausgangswert nähert. Sofort His-markierte Proteine durch Zugabe von fünf Millilitern HT-Elutionspuffer eluieren. Sammeln Sie den Durchfluss bei 0,5 bis einem Milliliter Fraktionen in Mikrofugenröhrchen, die mit HT-Elution gekennzeichnet sind.
Messen Sie den A280 der Elutionsfraktion. Wenn der A280 größer als 0,3 Milligramm pro Milliliter ist, verdünnen Sie die Fraktion mit HT-Gleichgewichtspuffer. Tauchen Sie die eluierten MMP-Fraktionen in Dialyseschläuche in einen Liter Dialysepuffer ein und rühren Sie den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius.
Auf einen Liter Dialysepuffer zwei geben und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Als nächstes auf einen Liter Dialysepuffer drei übertragen und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für nicht weniger als acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Geben Sie die Probe in einen geeigneten Behälter und kennzeichnen Sie sie als gewähltes MMP.
Untersuchen Sie das Rohr auf Niederschlag. Fügen Sie pro Milliliter Aliquot von einem Milligramm pro Milliliter MMP 50 Mikroliter 20 millimolar APMA hinzu, um eine endgültige APMA-Konzentration von einem Millimolar zu erreichen. Wenn sich ein Niederschlag bildet, zentrifugieren Sie ihn mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Lagern Sie den Überstand in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das mit aktiviertem MMP gekennzeichnet ist. Entsorgen Sie den Niederschlag in einen für APMA-Abfälle gekennzeichneten Behälter. SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die His-Tag-Reinigungselutionsfraktionen der katalytischen Domäne His-tag pro MMP-3 von BL21 DE3-Zellen in R2DP-Zellen zu vergleichen.
Die ersten acht Elutionsfraktionen der His-markierten MMP-Katalytikdomäne und BL21 DE3-Zellen zeigten weniger Protein als die in der His-markierten MMP-Katalytikdomäne in R2DP-Zellen. Es werden die induzierten, gefalteten, konzentrierten, aktivierten und entsalzten Fraktionen von MMP3-CD- und R2DP-Zellen gezeigt. Bei der Aktivierung beträgt das Molekulargewicht des aktivierten MMP-3-CD-Bandes etwa 20 Kilodalton, im Gegensatz zum His-markierten Zymogen, das bei etwa 30 Kilodalton verbleibt.
Beim Zentrifugieren von Zelllysaten sind Pellets möglicherweise nicht kompakt. Wenn das passiert, beschallen Sie mehr und zentrifen Sie länger. Bei der Rekonzentration des Proteins kann es zu Ausfällungen kommen.
Lösen Sie es in einem Lösungsvermittlerpuffer auf und wiederholen Sie den Vorgang. Das hier beschriebene Verfahren bietet eine detaillierte Methode zur löslichen Expression aktiver menschlicher MMPs, die schließlich verwendet werden kann, um den molekularen Mechanismus der enzymatischen Aktivität von MMP zu verstehen. Alternative Proteinreinigungsmethoden wie FPLC können an gereinigten MMP-Proteinen durchgeführt werden.
