US National Science Foundation ostasiatischen und pazifischen Summer Institutes;; der Geological Society of America Research Grant Program und den Alumni Grants for Graduate Research and Scholarship Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der US National Science Foundation (EAR-0920299 und EAR-0745808) unterstützt an der Ohio State University. Wir möchten den Editor und zwei anonymen Gutachtern für ihre wertvollen Kommentare danken.

Ein. MTB Sammlung <ol><li> Bei der Entscheidung über ein Süßwasser-Website, um magnetotaktischen Bakterien sammeln (MTB), ist es oft am besten, mit einem Teich oder langsam fließenden Bach, der einen weichen schlammigen Sedimenten Schicht beginnen. In dieser Demonstration sammelten wir eine Probe am Rande des Olentangy River auf dem Campus der Ohio State University (OSU) in Columbus, Ohio (USA). Dies war zwar eine günstige Lage für unsere Demonstration ist die hier beschriebene Protokoll für jeden Wasserorganismen Lage. Die Materialien in diesem Protokoll verwendet werden in Tabelle 1 zu finden. Finden einer Stelle, wo die Tiefe des Wassers liegt zwischen 10 und 100 cm. An einer solchen Stelle, sollten Sie sammeln die oberste Schicht des Sediments mit einer klaren, Schraub-Top-Container. Schaufel das Sediment und Wasser in den Behälter, bis er mit einem Drittel bis zur Hälfte Sediment und dem verbleibenden Volumen mit Wasser gefüllt ist. Halten Sie den Behälter getaucht, bis es mit Wasser gefüllt ist und dann dicht verschließen den Behälter wit seiner Schraub-Deckel. Es ist nicht notwendig, um das Sediment zu mischen. Wischen Sie die Außenseite des Behälters mit einem Handtuch trocken und nehmen Sie dann die Probe auf Ihrem Labor. Es ist nicht notwendig, die Probe so schnell wieder in Ihrem Labor. Wir haben MTB Proben in Kunststoff-Behältern im Bereich links für mehrere Tage, bevor er sie zurück zu unserem Labor. Die MTB lebensfähig sein sollten für mehrere Wochen bis Monate, so lange Sie die Proben an einem kühlen, schattigen Ort auf dem Feld. </li><li> Nachdem die Probe im Labor, lösen Sie den Deckel und lassen Sie ihn für den Behälter, um die Menge der Verdunstung zu reduzieren. Bewahren Sie die Behälter bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum, Schublade oder vollständig bedecken den Behälter mit Aluminiumfolie. Erlauben das Sediment und feine Teilchen vollständig auf dem Boden des Behälters ab, indem man die Probe ungestört für einige Stunden bis mehrere Tage. Es ist nicht notwendig, um das Sediment zu mischen, bevorzugen MTB einen ungestörten Umfeld. Die klaren Wände des Kunststoffbehälterskönnen Sie bestätigen, dass die Teilchen auf den Boden nieder. Abhängig von Ihrer Probe können MTB in der Probe verbleiben Leben für viele Monate. </li></ol> 2. MTB Isolation <ol><li> Wenn Sie bereit sind, um die MTB, Ort Magneten auf den Seiten der Kunststoff-Behälter ca. 1 cm über der Sediment-Wasser-Grenzfläche (Abbildung 1A) zu isolieren sind. Achten Sie darauf, um das Sediment am Boden des Behälters zu stören. Setzen Sie den Südpol eines Stabmagneten auf der einen Seite des Behälters und der Nordseite des anderen Stabmagneten auf der gegenüberliegenden Seite (Abbildung 1A). Fast jedes Magneten verwendet werden, wie etwa einem magnetischen Rührstab oder große Magnete. Alles kann verwendet werden, um die Magneten in der richtigen Höhe über dem Sediment-Wasser-Grenzfläche zu unterstützen. Wir haben festgestellt, dass die aufliegenden Magnete auf der Oberseite eines Papp-oder Kunststoff-Box ist sehr gut, jedoch sind die Magnete auch zur Außenseite des Kunststoffbehälters abgeklebt werden. Warten Sie 30 min bis zu mehrerenStunde für die Bakterien zu dem Magneten zu schwimmen. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Pipette sorgfältig sammeln das Wasser aus dem Inneren des Behälters (1A) in der Nähe der Position des Südpol Stabmagneten (für Proben in der nördlichen Hemisphäre gesammelt). Dieses Wasser sollte die MTB, die zum Südpol Stabmagneten angezogen worden sind. Weiter sollte eine Kapillare Rennstrecke zur weiteren Bereicherung des MTB werden. </li></ol> 3. MTB Racetrack <ol><li> Um Ihre Probe mit magnetotaktischen Bakterien anzureichern, ist eine Kapillare Rennstrecke notwendig (1B und 1C). Diese müssen vor dem Isolieren der Zellen aus dem klaren Plastikbehälter hergestellt werden. </li><li> Verwenden Sie einen 5,75 Zoll (146 mm) Glas Pasteurpipette eine Rennstrecke zu machen. Verwenden eines Diamant Stift oder Datei abzuschneiden die Spitze der Pipette, ist die Länge der Pipette nicht entscheidend, aber es sollte in der Lage sein, um etwa 1-2 ml Wasser enthalten. Weiter, verwenden Sie einen Bunsenbrenner, um die Spitze zu schmelzen, so dasses wird abgedichtet (Abbildung 1C). Die resultierende Pipette sollte ein offenes Ende und ein verschlossenes Ende. </li><li> Machen Sie mehrere dieser Rennstrecken und dann Autoklaven. Darüber hinaus werden Sie brauchen, um Baumwolle und mehrere lange Metall-Nadeln autoklavieren. </li><li> Hinzufügen filtrierten Probe Wasser, aus der Nähe der Sedimentwasserschnittstelle in 1A gezeigt gesammelt, zu einer autoklavierten Rennstrecke Verwendung eines langen metallischen Nadel an einer Spritze filtriert. Die Porengröße des Filters 0,22 mm sollte, um Verschmutzungen und Verunreinigungen aus dem Wasser zu beseitigen. Es ist wichtig, absolut sicher sein, dass keine Luftblasen in der Glaskapillare. </li><li> Stecken Sie den unteren Rand der Rennstrecke mit steriler Baumwolle (Abbildung 1B). Verwenden Sie die Metall-Nadel, die Baumwolle in Richtung der verschlossenen Ende der Rennstrecke drücken so dass es 0,5 - 1 cm entfernt von der versiegelten Spitze (Abbildung 1C). </li><li> Mit einer sterilen Pipette, fügen Sie den MTB-haltigem Wasser (aus Abschnitt 2.2) auf die Probe reservoir (open end) einer vorbereiteten MTB Rennstrecke (Abbildung 1B). </li></ol> 4. MTB Enrichment <ol><li> Sobald die Rennstrecke mit der Probe gefüllt ist, lag es auf der Seite auf einer horizontalen Fläche (zB ein Tischgerät) und platzieren Sie den Südpol eines Stabmagneten (in der nördlichen Hemisphäre) neben dem verschlossenen Spitze der Rennstrecke (1B und 1C). </li><li> Nach 5 bis 30 Minuten für die MTB durch die Baumwolle zu migrieren. Dann sollten Sie sammeln das Fluid in der Nähe der Spitze der Rennstrecke. Zu lange warten können Verunreinigungen, z. B. andere bewegliche Bakterien, auf die Spitze der Kapillare einzubringen. Optional können Sie auch ein Lichtmikroskop, um die Spitze der Rennstrecke sehen und beobachten das MTB an der Rennstrecke Geheimtipp sammeln. Dies ermöglicht Ihnen zu bestimmen, wie lange es die MTB durch die Wattestopfen migrieren dauert. </li><li> Drücken Sie vorsichtig mit dem Diamantmesser einen kleinen Kratzer in der Nähe Wattestopfen machen und lassen Sie das Ende der Rennstrecke. </li> &lt;li&gt; Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer schmalen Nadel (25 oder 27 Gauge), um die Flüssigkeit von der Spitze der Rennstrecke entfernen. Diese flüssige Probe sollte nun der angereicherten MTB. </li></ol> 5. MTB Beobachtung durch Lichtmikroskopie <ol><li> Geben Sie einen Tropfen (10-20 ul) des angereicherten MTB Probe auf einem Deckglas. </li><li> Schnell drehen das Deckglas auf, so dass die Tropfen wird nun nach unten und hängen von dem Deckglas. </li><li> Platzieren des Deckplättchens auf einen O-Ring, der auf einem Glas-Objektträger ruht. Der O-Ring soll einen geringfügig kleineren Durchmesser als das Deckglas (etwa 1 cm, Abbildung 2). </li><li> Legen Sie diese hängenden Tropfen auf einem Lichtmikroskop Bühne und konzentrieren sich auf eine Kante des Tropfens. Ein 60X Trockenobjektiv funktioniert sehr gut, da die meisten eine hohe numerische Apertur (NA, z. B. 0,93) haben, aber nicht erfordern Öl, das schwer zu hängenden Tropfen-Verfahren (Abbildung 2) zu verwenden ist. </li><li> Legen Sie das südliche Ende eines Stabmagneten in der Nähe des hängenden drop und MTB beginnt in Richtung der Kante des Tropfens am nächsten zu dem Magneten (Abbildung 3) zu migrieren. Innerhalb von wenigen Minuten viele MTB sollte an der Kante des Tropfens (Abbildung 3). Beweisen Sie sich, dass die Bakterien magnetischen durch die Umkehrung der Pole des Magneten sind und dann beobachten, die Bakterien schwimmen in die entgegengesetzte Richtung. </li></ol> 6. MTB Beobachtung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) <ol><li> Geben Sie einen Tropfen (~ 20 ul) der angereicherten MTB auf eine Kupfer-Netz und damit die Bakterien für 10 Minuten absetzen. </li><li> Wick Sie überschüssiges Wasser mit einem Stück von sauberem Filterpapier. </li><li> Optional kann das Gitter negativ mit 2% Uranylacetat, 2% Phosphorwolframsäure, pH 7,2, oder 2,5% Natriummolybdat 7, 8, 9 gefärbt werden. Dies geschieht, indem die Kupfer-Gitter auf einem Tropfen Fleck unmittelbar nach Inkubation des Gitters mit der angereicherten MTB getan. Inkubieren des Gitters mit der negativen Beize werden die Zeiten in Abhängigkeit von der strain verwendet und dann Docht aus der Flüssigkeit mit einem sauberen Filterpapier. </li><li> Beachten Sie die MTB mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Abbildung 4). Für die hier beschriebenen Arbeiten MTB wurden Formvar stabilisiert und Kohlenstoff beschichtet 200 mesh Kupfergittern (Ted Pella # 01800) adsorbiert. Die Gitter mit dem Kohlenstoff Seite wurden auf einem Tropfen Zellsuspension für bis zu 10 min platziert, dann sofort gewaschen einmal, indem das Gitter auf einem Tropfen Wasser für 30 Sekunden. Zur Anfärbung wurden die Gitter auf einem Tropfen von 2% Uranylacetat (Ted Pella # 19.481) für 30 platziert sec bis 5 min und dann getrocknet komplett mit einem Stück Filterpapier. Die Gitter wurden mit TEM entweder mit einem FEI Tecnai Spirit bei 80kV oder einer FEI Tecnai F20 mit hohen Winkel ringförmigen Dunkelfeld-STEM bei 200kV analysiert. </li></ol>

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	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190, 377-379 (1975).</li><li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).</li><li>Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Biomineralization+of+Magnetite+(Fe3O4)+and+Greigite+(Fe3S4)+in+a+Magnetotactic+Bacterium.">Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).</li><li>Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cultured+Greigite-Producing+Magnetotactic+Bacterium+in+a+Novel+Group+of+Sulfate-Reducing+Bacteria.">A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria.</a> Science. 334, 1720-1723 (2011).</li><li>Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=South-seeking+magnetotactic+bacteria+in+the+Northern+Hemisphere.">South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere.</a> Science. 311, 371-374 (2006).</li><li>Wolfe, R., Thauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'capillary+racetrack'+method+for+isolation+of+magnetotactic+bacteria.">A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).</li><li>Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+structure+in+a+many-celled+magnetotactic+prokaryote.">Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote.</a> Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).</li><li>Moench, T. T., Konetzka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+isolation+and+study+of+a+magnetotactic+bacterium.">A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium.</a> Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).</li><li>Balkwill, D., Maratea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+a+magnetotactic+spirillum.">Ultrastructure of a magnetotactic spirillum.</a> Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).</li><li>Lins, U., Freitas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+homemade+apparatus+for+harvesting+uncultured+magnetotactic+microorganisms.">Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).</li><li>Jogler, C., Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Cloning+of+the+Magnetotactic+Metagenome:+Identification+of+Magnetosome+Island+Gene+Clusters+in+Uncultivated+Magnetotactic+Bacteria+from+Different+Aquatic+Sediments.">Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).</li><li>Lin, W., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+Isolated+but+Uncultivated+Magnetotactic+Bacterium+of+the+Phylum+Nitrospirae+from+Beijing,+China.">Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).</li><li>Li, J., Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization,+crystallography+and+magnetic+properties+of+bullet-shaped+magnetite+magnetosomes+in+giant+rod+magnetotactic+bacteria.">Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria.</a> Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).</li><li>Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosomes+and+magnetite+crystals+produced+by+magnetotactic+bacteria+as+resolved+by+atomic+force+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1331-1335 (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Magnetbakterien sind nicht unbedingt in jeder Gewässer 8 gefunden, aber wenn sie eintreten, können sie in der Größenordnung von 100 gefunden werden - 1000 Zellen pro Milliliter 2. Um die MTB mittels optischer Mikroskopie beobachten, benötigen Sie etwa 50 Bakterien / ml in Ihrer Probe 8. Wenn es keine oder nur wenige MTB in Ihrer Probe sind, dann müssen Sie entweder eine neue Umwelt-Website auswählen, um Ihre Proben zu sammeln oder müssen Sie eine oder mehrere der Techniken im nä...

<table border="1"><tbody><tr><td> Item Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95933 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Pasteurpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td></td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> Eisenwarengeschäft </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542B </td><td></td></tr><tr><td> Stabmagnet </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95957 </td><td></td></tr><tr><td> Container </td><td> Jeder </td><td></td><td> Jede plastic oder Glasbehälter, die mindestens 0,5 L halten kann und abgedichtet werden kann </td></tr><tr><td> Baumwolle </td><td> Jeder </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop mit 60X trockene Linse </td><td> Zeiss </td><td></td><td> A 60X trockene Linse ist nicht zwingend erforderlich, aber das gibt eine hohe NA ohne Öl </td></tr><tr><td> Diamant pen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 mm-Filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-719C </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9788564 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar / Carbon200 mesh, Kupfergittern </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 01800 </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 19481 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Geist TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment

Magnetotaktische Bakterien (MTB) sind im Wasser lebende Mikroorganismen, die zuerst vor allem in 1975 1 wurden aus Sedimentproben in Salzwiesen of Massachusetts (USA) gesammelt beschrieben. Seitdem MTB haben im Schichtbetrieb Wasser-und Sediment-Säulen wurden aus der ganzen Welt 2 entdeckt. Ein gemeinsames Merkmal aller MTB ist, dass sie Magnetosomen, die intrazelluläre Membran-gebundenen magnetischen Nanokristalle aus Magnetit (Fe 3 O 4) und / oder Greigit (Fe 3 S 4) oder beide 3, 4 sind enthalten. In der nördlichen Hemisphäre, werden MTB typischerweise mit dem südlichen Ende eines Stabmagneten angezogen, während in der südlichen Hemisphäre sie in der Regel bis zum nördlichen Ende eines Magneten 3,5 angezogen werden. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, wenn sie versuchen, MTB aus Umweltproben zu isolieren. Einer der gebräuchlichsten Methoden zum MTB bereichern ist eine klare Kunststoff-Behälter zu verwenden, um Sediment und Wasser aus einer natürlichen Quelle sammeln,wie einem Süßwasser Teich. In der nördlichen Hemisphäre ist das südliche Ende eines Stabmagneten an der Außenseite des Behälters oberhalb des Sediments an der Sediment-Wasser-Grenzfläche platziert. Nach einiger Zeit können die Bakterien aus dem Inneren des Behälters in der Nähe des Magneten mit einer Pipette entfernt und dann weiter unter Verwendung eines Kapillar-Rennstrecke und einen Magneten 6 angereichert. Sobald angereichert, die Bakterien auf einem Objektträger mit einem hängenden Tropfen Verfahren platziert werden und beobachtet im Lichtmikroskop oder abgeschieden auf einem Kupfergitter und beobachtet mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Mit dieser Methode können isolierte MTB untersucht mikroskopisch Eigenschaften wie Schwimmen bestimmen Verhalten, Art und Anzahl der Geißeln, Zell-Morphologie der Zellen, die Form der magnetischen Kristalle, die Anzahl der Magnetosomen, die Anzahl der Magnetosomenketten in jeder Zelle, die Zusammensetzung der die nanomineral Kristalle, und das Vorhandensein der intrazelluläre Vakuolen.

Ein Magnet ist ein wirksames Werkzeug, um magnetotaktischen Bakterien (MTB) in Umweltproben (Abbildung 1A) enthalten isolieren. Eine Kapillare Rennstrecke (1B) nutzt die magnetischen Eigenschaften der MTB, um sie durch einen Wattestopfen wo sie aus nicht magnetotaktischen Mikroorganismen auch in der Umweltprobe enthaltenen getrennt werden können anzuziehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50123/50123fig1.jp...

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Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Wir demonstrieren eine Methode, um magnetotaktischen Bakterien (MTB), die natürlichen Gewässern angewendet werden können sammeln. MTB isoliert und angereichert werden von Sedimentproben mit einem relativ einfachen Setup, das zu Nutze macht die Bakterien die natürlichen Magnetismus. Isolated MTB können anschließend im Detail sowohl mit Licht-und Elektronenmikroskopie untersucht werden.

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Aufrufe.  The Ohio State University. Wir demonstrieren eine Methode, um magnetotaktischen Bakterien (MTB), die natürlichen Gewässern angewendet werden können sammeln. MTB isoliert und angereichert werden von Sedimentproben mit einem relativ einfachen Setup, das zu Nutze macht die Bakterien die natürlichen Magnetismus. Isolated MTB können anschließend im Detail sowohl mit Licht-und Elektronenmikroskopie untersucht werden.

Serie: Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Forschung

Biologie

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. Birds are widely used subjects in biological research and are ideal for studies involving repeated sperm samples. However, few resources are currently available for those wishing to learn how to collect and extract DNA from avian sperm. Here we describe cloacal massage, a gentle, non-invasive manual technique for collecting avian sperm. Although this technique is established in the literature, it can be difficult to learn from the available descriptions. We also provide information for extracting DNA from avian semen using a commercial extraction kit with modifications. Cloacal massage can be easily used on any small- to medium-sized male bird in reproductive condition. Following collection, the semen can be used immediately for motility assays, or frozen for DNA extraction following the protocol described herein. This extraction protocol was refined for avian sperm and has been successfully used on samples collected from several passerine species (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, and Turdus migratorius) and one columbid (Columba livia).

This protocol describes cloacal massage, a non-invasive manual technique for collecting semen from birds, and DNA extraction from avian sperm using a commercial extraction kit with modifications.

Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ability to biomineralize magnetosomes, which are magnetic nanometer-sized crystals of magnetite (Fe3O4) or greigite (Fe3S4) surrounded by a lipid bilayer membrane, within their cytoplasm. For most known magnetotactic bacteria, magnetosomes are assembled in chains inside the cytoplasm, thereby conferring a permanent magnetic dipole moment to the cells and causing them to align passively with external magnetic fields. Because of these specific features, magnetotactic bacteria have a great potential for commercial and medical applications. However, most species are microaerophilic and have specific O2 concentration requirements, making them more difficult to grow routinely than many other bacteria such as Escherichia coli. Here we present detailed protocols for growing three of the most widely studied strains of magnetotactic bacteria, all belonging to the genus Magnetospirillum. These methods allow for precise control of the O2 concentration made available to the bacteria, in order to ensure that they grow normally and synthesize magnetosomes. Growing magnetotactic bacteria for further studies using these procedures does not require the experimentalist to be an expert in microbiology. The general methods presented in this article may also be used to isolate and culture other magnetotactic bacteria, although it is likely that growth media chemical composition will need to be modified.

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

We present a procedure for growing several strains of Magnetospirillum in two different types of growth media. Magnetospirillum gryphiswaldense strain MSR-1 is grown in both liquid and O2 concentration gradient semi-solid media while M. magneticum strain AMB-1 and M. magnetotacticum strain MS-1 are grown in liquid medium.

Wachsende Magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Sammlung und Identifizierung von Pollen aus Honigbienenvölkern

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Swabbing the Urban Environment - Eine Pipeline zur Probenahme und zum Nachweis von SARS-CoV-2 aus Umweltreservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...