Wir danken Dr. Yijun Song, und die Mitglieder des Hattar Kuruvilla Zhao tri-Labor des Fachbereichs Biologie, Johns Hopkins University für Rat und Hilfe. Unterstützt durch NIH gewährt DC007395 und DC009946.

Teil 1. Die EOG Aufnahme-Setup Die Aufnahme Apparat besteht aus einer Aufnahme, Referenzelektrode, Luft-Zuführungsrohr, Objekttisch und Binokular, alle auf einer Luft-Tabelle in einem Faradayschen Käfig verankert. Mikromanipulatoren sind für die Platzierung der Elektroden und die Luft Zuführungsrohr verwendet. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird durch destilliertes Wasser geleitet, um Feuchtigkeit, bevor sie durch die Luft Zuführungsrohr und über die Probe hinzufügen. Ein 60 mm Kulturschale mit Sylgard zu einer Tiefe von 6-8 mm gefüllt ist als Montagefläche für die Probe verwendet. Ein Brunnen und ein Kanal aus dem Sylgard in der Montage Gericht um ein Mittel bereitzustellen, um elektrischen Verbinden der Referenzelektrode auf die Probe über modifizierte Ringer-Lösung ausgehöhlt. Die Aufnahme-Elektrode und der Referenzelektrode sind an einen Verstärker angeschlossen. Signale aus dem Verstärker sind mit einem Digitizer gesendet und dann an einen Computer. Software wie Axograph oder pClamp kann die Stimulation Protokoll steuern, um das Signal aufnehmen, und für die anschließende Analyse der Antworten sein. Ein Oszilloskop nach dem Verstärker angeschlossen werden können für die Echtzeit-Überwachung des elektrischen Potentials beim Aufsetzen der Aufnahme-Elektrode und während EOG Aufnahmen bequem. Lieferung von Geruchsrezeptoren Reize wird durch eine Picospritzer, die auf dem gleichen Computer zur Signalerfassung eingesetzt angeschlossen gesteuert wird. Der Luftdruck an der Picospritzer ist auf 10 psi eingestellt. Ein einziger Lufttank und Regler lassen sich Luft, um sowohl die Luft-Tabelle und die Picospritzer zu versorgen. Eine zweite Luft Tank und Regler wird verwendet, um Luft für die befeuchtete Luft Strom liefern, als dies erfordert einen geringeren Druck und eine große Menge des Luftstroms. Kurz vor der Bereitstellung eines Geruchs Reiz ist die Picospritzer Ausgang mit einem Duftstoff-Flasche angeschlossen. Der Duftstoff-Flasche wird dann an der Luft Zuführungsrohr verbunden. Teil 2: Herstellung von Elektroden Die Aufnahme Elektrode ist ein chlorierten Silberdraht in einer gezogenen Glas mit modifizierten Ringer-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, sterilfiltriert) gefüllte Kapillare. Die Bezugselektrode ist eine chlorierten Silberdraht. <ol><li> Installieren Silberdraht in den Elektrodenhalter. Für die Aufnahme Elektrode sollte 1-2 Zentimeter Draht aus dem Ende der Elektrode Halter herausragen. Mehr Draht kann für die Referenzelektrode gelassen werden. </li><li> Um die AgCl Schicht auf den Silberdraht hinzuzufügen, positionieren Sie den Draht in 0,1 M NaCl und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem Pluspol einer 1,5-9 V DC Stromquelle. Der negative Pol der Stromquelle sollte elektrisch mit dem 0,1 M NaCl-Lösung verbunden werden. Lassen Sie die chloriding Reaktion für 10 Minuten gehen. Zum Ausgleich keine statische Aufladung zwischen der Aufnahme und der Referenz-Elektrode, kurz berühren die Elektroden zusammen, bevor Sie sie auf dem Aufzeichnungsgerät. </li><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einer Mikropipette Abzieher. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 5-10 Mikrometer im Durchmesser sein. </li><li> Verwenden Sie einen Diamanten Bleistift ein Tor und brechen das stumpfe Ende der Kapillare so ~ 2 cm länger als der Silberdraht ist. Fire-Politur das abgeschnittene Ende mit dem Butan Fackel. </li><li> Melt 0,5% Agarose in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie eine kleine Menge des geschmolzenen Agarose-Lösung in die Spitze der Elektrode mit einer Transferpipette. </li><li> Füllen Sie die Kapillare gezogen über 1 / 2 des Weges mit modifizierten Ringer-Lösung (mit einer Spritze, die erhitzt worden und zog einen langen, dünnen Ende haben, ist für diesen Zweck nützlich). Gently flick die Kapillare, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie die gefüllten Elektrode in den Vorratsbehälter mit einer kleinen Menge von modifizierten Ringer-Lösung in den Boden, bis sie bereit sind, verwendet werden sollen. Sobald eine Gewebeprobe wird vorbereitet und bereit für die Aufnahme, installieren Sie eine gefüllte Kapillare über die Aufnahme Drahtelektrode. </li></ol> Teil 3: Vorbereitung Duftstoff-Lösungen Die Geruchsstoffe Amylacetat und Heptaldehyd wecken große Antworten und sind somit eine gute Wahl, wie EOG Stimulanzien. <ol><li> In Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine Reihe von Verdünnungen von Geruchsrezeptoren in Dimethylsulfoxid (DMSO). Als Ausgangspunkt für eine Dosis-Wirkungs-Kurve, bereiten 10-fach Verdünnungen von 5 m bis 5 x 10 -6 M. Machen Sie frische Verdünnungen jeden Tag. </li><li> Weitere verdünnen Geruchsstoffe 50-fach in Wasser durch Mischen von 100 ul verdünnt Lager in DMSO mit 4,9 mLs Wasser in 2 Unzen-Flaschen mit Silikon-Stopfen. Lassen Sie die Lösungen in die Flaschen ins Gleichgewicht für mindestens 30 Minuten. Beachten Sie, dass der Dampf Konzentration von Geruchsstoffen in jeder Flasche unbekannt ist, wird aber in Abhängigkeit von der Konzentration der Duftstoffe in der flüssigen Phase variieren. </li><li> Legen Sie zwei 18-Gauge-Nadel durch das Silizium Anschlag auf provide Eingang und-Ausgang. Die Häfen sollten angeschlossen werden, wenn die Flasche nicht in Gebrauch ist. </li></ol> Teil 4: Aufzeichnung des EOG und Analyse von Daten <ol><li> Sacrifice eine Maus durch CO 2-Euthanasie oder betäubende Überdosierung durch Enthauptung folgten. Entfernen Sie die Haut über den Schädel und sagittal halbieren dem Kopf entlang der Mittellinie. </li><li> Hängen Sie eine Hälfte des Kopfes, medial nach oben auf die Halterung Gericht. Entfernen Sie vorsichtig das Septum der Nasenmuscheln aussetzen. </li><li> Die Schale mit montiertem Gewebe auf die Aufnahme der Bühne. Richten Sie die Bühne, so dass die Aufnahme Lage auf dem Nasenmuscheln unter dem Mikroskop zentriert ist. </li><li> Schalten Sie den Lufttank zu befeuchtete Luft auf die Nasenmuschel Oberfläche liefern. Positionieren Sie die Luftzufuhr Rohr, so dass es etwa 10 mm vom Aufnahmeort. Der Durchfluss wird ~ 600 mL / min. </li><li> Stellen Sie den Verstärker an DC-Modus (AC Verstärkung wird Artefakte in der EOG-Signal zu induzieren) mit Low-Pass-Filter bei 1 kHz, und Verstärkung bei 100X. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme-und Referenzelektrode auf der Mikromanipulatoren. </li><li> Senken Sie die Referenz-Elektrode in den Brunnen auf der Montagefläche legen und mit modifizierten Ringer-Lösung, so dass es elektrisch mit dem Gewebe verbunden. </li><li> Vorsichtig das Aufnahme-Elektrode auf die Oberfläche der Nasenmuschel IIb oder III. Die Elektrode sollte kaum berühren die Oberfläche des olfaktorischen Epithels! Wenn die Elektrode in Kontakt mit dem Epithel kommt (dh Abschluss einer elektrischen Schaltung) wird eine gerade Basislinie wird im Oszilloskop angezeigt werden. </li><li> Bringen Sie einen Geruchsstoff Flasche auf die Seite Port auf dem Luft-Zuführungsrohr. </li><li> Auf dem Computer, starten Sie eine Stimulation Protokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte 2 kHz oder höher sein. Die Software löst ein Geruch Puls und Aufzeichnung starten. </li><li> Ein typisches Stimulationsprotokoll kann ein 100-ms Dauer einzelner Impuls, gepaart 100-msec Pulse durch einen 1-Sekunden-Intervall getrennt, oder eine 10-sec Dauerimpuls werden. </li><li> Warten Sie einige Zeit zwischen den Protokollen, so das Gewebe minimal angepasst ist. Eine Minute reicht für flüssige Konzentrationen von Amylacetat und Heptaldehyd bis zu 10 -3 M, bei höheren Konzentrationen können 5 Minuten. Nach der Abgabe hoher Geruchs-Konzentrationen (z. B. am Ende einer Dosis-Wirkungs-Kurve) Restgeruch kann in der Röhre bleiben. Waschen Sie den Luftschlauch mit 95% Ethanol und trocken, bevor Sie fortfahren mit zusätzlichen Gewebeproben. </li><li> Axograph Software bietet Werkzeuge für die Messung wichtigen Parameter der EOG-Signal. Solche Parameter sind die Antwort Amplitude, Latenz, die Zeit bis Spitze, und Zeitkonstanten der Kündigung. Es kann wünschenswert sein, um digital Filter Spuren bei 25 Hz vor der weiteren Analyse. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Parameter für die EOG-Analyse. Verschiedene Parameter der EOG sind besonders nützlich für den Vergleich der Antworten zwischen Mäusen, einschließlich der Reaktion Amplitude, die Latenz (die Zeit zwischen dem Reiz verabreicht wird und die Reaktion beginnt), steigen (die Zeit zwischen dem Start der Reaktion und der Spitze), Zeit bis zur maximalen (die Zeit vom Beginn der Stimulation an die Spitze der Reaktion) und Zeitkonstante der Kündigung (τ, bestimmt durch den Einbau der Decay-Phase der Reaktion auf eine einzelne Exponentialgleichung ). Zum Vergleich der kinetischen Parameter wie Latenz, Anstiegszeit und Zeitkonstante der Kündigung, ist es ratsam, die Spitzenamplitude der Antworten vor der Analyse zu normalisieren. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Vertreter EOG-Signale unter verschiedenen Stimulationsprotokolle. (A) Beispiele für EOGs von einer Maus in Reaktion auf die Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Amylacetat. Die schwarze Linie am oberen Rand des Panels zeigt den Zeitpunkt und die Dauer von Geruchsrezeptoren Stimulation. Die Konzentrationen in der Legende sind die Konzentrationen der flüssigen Lösung. (B) Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung im Durchschnitt von fünf Mäusen. Fehlerbalken sind 95% Konfidenzintervall. Ein Rückgang in der Amplitude ist oft bei sehr hohen Konzentrationen Geruch beobachtet. (C) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf ein gekoppeltes-Puls-Stimulation. Ein einzelner kurzer Impuls von Geruchsrezeptoren entlockt Anpassung dauert mehrere Sekunden. (D) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf eine 10-sec anhaltenden Duftstoff Stimulation. Die EOG zeigt Desensibilisierung während der kontinuierlichen Geruchsstoff Präsentation.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. 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D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Die Mäuse wurden behandelt und mit Methoden, die von der Animal Care und Verwenden Ausschüsse der Johns Hopkins University genehmigt eingeschläfert.

Mit dem Setup in diesem Protokoll beschrieben, wird der Duftstoff Reize an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels Einklang zwischen Gewebe Vorbereitungen, so dass für den Vergleich zwischen Wildtyp und Mutante Mäuse, obwohl die genaue Odoriermittelkonzentration und Dynamik unbekannt sind. Mehrere Faktoren, insbesondere der Aufnahmeort und die Fließgeschwindigkeit des befeuchtete Luft, zu Schwankungen in der EOG. Es sollte darauf geachtet, von ähnlichen Positionen auf der gleichen Nasenmuschel Datensatz Variation zu minimieren. Dies kann leicht durch die konsequente Aufnahme von der gleichen Seite des Kopfes und halten den Fußabdruck des Mikroskops, Geruch Zuführungsrohr und Mikromanipulatoren auf dem Luft-Tabelle unverändert zwischen Gewebeproben erreicht werden. Darüber hinaus sollten Gewebeproben sofort in die befeuchtete Luftstrom untergebracht werden nach der Sektion Austrocknung des Gewebes zu verhindern. EOG-Aufnahmen an Mäusen kann auch mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur auf präparierten Maus durchgeführt werden Nasenmuscheln 7, 14, 15, oder indem man den Kopf intakt und das Einsetzen der Elektrode in ein kleines Loch über dem Nasenmuscheln 16, 17 gebohrt. Jede Veränderung der EOG Aufnahme hat seine eigenen Stärken: Luft-Phasen-Aufnahmen auf Gewebe Zubereitungen, die als in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren erfordern ein Minimum an Setup und sind am einfachsten zu führen; Aufnahmen mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur erleichtern den Einsatz von pharmakologischen Reagenzien, obwohl die hydrophoben Charakter vieler Geruchsstoffe erschwert Geruch Lieferung; schließlich Aufnahmen, in denen der Kopf bleibt intakt ist, kann in &quot;künstliche schnüffeln &#39;Experimente verwendet werden, obwohl die Platzierung der Elektroden ist schwieriger, als wenn die Nasenmuscheln sind voll ausgesetzt.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Tiere abhängen Geruchssinn für viele kritische Verhaltensweisen, wie die Suche nach Nahrung, Vermeidung von Raubtieren, und die Identifizierung Artgenossen zur Paarung und anderen sozialen Interaktionen. Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen, und zuverlässige Methode, um Test Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Seit der 1956 Beschreibung des EOG durch Ottoson in Frösche 1 hat die EOG Aufnahme in vielen Wirbeltieren, einschließlich Salamander, Kaninchen, Ratten, Mäusen und Menschen (Bewertet von Scott und Scott-Johnson, 2002, ref. 2) angewendet worden. Die jüngsten Fortschritte in der genetischen Modifikation in Mäusen haben Interesse an der Aufnahme der EOG für physiologische Charakterisierung der olfaktorischen Funktion in Knock-out neu entfacht und knock-in Mäusen. EOG-Aufnahmen wurden erfolgreich eingesetzt, um die zentrale Rolle der olfaktorischen Signaltransduktion Komponenten 3-8 zeigen, und in jüngerer Zeit auf den Beitrag bestimmter Regulationsmechanismen zu OSN Antworten 9-12 charakterisieren. Odorant Erkennung tritt an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf der Zilien OSNs, wo eine Signaltransduktionskaskade führt zu der Ionenkanäle öffnen und erzeugt einen Strom, der in die Zilien fließt und depolarisiert die Membran 13. Die EOG ist das negative Potential extrazellulär an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf Geruchsstoff Stimulation aufgezeichnet, die sich aus einer Summierung der möglichen Veränderungen von einzelnen reagieren OSNs in der Aufnahme Feld 2 verursacht. Vergleich der Amplitude und Kinetik der EOG somit wertvolle Informationen darüber, wie genetische Modifikation und andere experimentelle Manipulationen Einfluss auf die molekulare Signalwege zugrunde liegenden OSN Reaktion auf Geruch. Hier beschreiben wir eine Luft-Phase EOG Aufnahme auf eine Vorbereitung der Maus olfaktorischen Nasenmuscheln. Kurz, nachdem dabei die Maus, sind die olfaktorischen Nasenmuscheln durch Halbierung der Kopf entlang der Mittellinie und das Entfernen des Septum ausgesetzt. Die Nasenmuscheln Präparat wird dann in den Aufnahme-Setup gelegt, und eine Aufnahme-Elektrode an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf einer der medialen Nasenmuschel platziert. Eine Referenzelektrode ist elektrisch mit dem Gewebe durch eine Pufferlösung verbunden. Ein kontinuierlicher Strom von befeuchtete Luft über die Oberfläche des Epithels, um ihn feucht zu halten geblasen. Der Dampf von Geruchsrezeptoren Lösungen ist in den Strom der befeuchtete Luft auf das Epithel stimulieren aufgeblasen. Antworten werden aufgezeichnet und digitalisiert für die weitere Analyse.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Serie: Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em&gt; Drosophila</em&gt; In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...