Diese Studie wird von NIH DC052256 und DC006015 und NSF 0324769 zu QG und T32-DC008072 BS unterstützt.

1. Vorbereitung Dieses Verfahren ist Sicherheitsstufe 2, also all die folgenden Vorbereitungen sind in einem biohazard Haube, wo die Mikroinjektion Verfahren durchgeführt hat. <ol><li> Vorbereitung und Vorwärmung einem 37 ° C Wasserbett: Füllen Sie eine Plastik Aufbewahrungstasche mit Wasser - Dichtung und auf eine entleerte Heizblock Inkubator. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen. </li><li> Füllen Sie ein biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf eine angemessene Lautstärke zum Eintauchen des gesamten Abfalls aus diesem Verfahren. </li><li> Bereiten Sie eine kleine offene Schale mit 70% Ethanol und eine zweite Schüssel mit sterilisiert ddH2O Ort und in der biologischen Sicherheitswerkbank. </li><li> Sterilisieren ein 5μL Kapazität Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel durch Besprühen Sie den Körper und die Nadel mit 70% Ethanol mit dem Kolben herausgezogen all the way. Immer wieder absaugen Ethanol aus der Schale und werfen Sie sie den ganzen Weg aus mindestens 5-mal. </li><li> Spülen Sie die Spritze Patrone durch Absaugen und Auswerfen sterilem Wasser mindestens 5-mal. Legen Spritze sicher beiseite in die Kultur Kapuze und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Sie Virus Aktien von -80 ° C Gefrierschrank Lagerung und auf Eis stellen können Auftauen. Mikroinjektion erfordert 2μL Virus-Bestand pro Maus bei einem Titer von 10 9 infektiöse Einheiten / ml. Lentiviren können im Handel bezogen werden oder im Labor hergestellt nach dem etablierten Protokoll (Lois et al., 2002). </li><li> Bereiten Sie eine Injektion der Bühne, dass einem Bereich oberhalb der Motorhaube Oberfläche gehoben bietet - ein 10cm Kulturschale mit einem Blatt Kimwipe abgedeckt verwenden. </li><li> Vereinbaren Alkoholtupfern in der Nähe der Injektionsstelle entfernt. </li></ol> 2. Mikroinjektion von lentiviralen Partikeln in die olfaktorischen Epithel Alle tierischen Verfahren in dieser Methode durchgeführt werden nach IACUC genehmigten Richtlinien durchgeführt. Das Mus musculus Stammes C57BL/6J ist im Tiermodell in allen Versuchen verwendet hier gezeigt. <ol><li> Betäuben Maus Welpen durch Hypothermie, indem sie eine Maus pup (P0-P3) aus dem Käfig und setzen den Welpen auf einer aufgeschnittenen Handschuh auf Eis für 5 Minuten. </li><li> Während des Wartens auf den Welpen voll narkotisiert, absaugen 2μL von viralen Lager werden in der sterilisierten Hamilton-Spritze. </li><li> Platzieren Sie die Maus Welpe auf der Injektion der Bühne. Ziehen Haut weg von der Oberseite des Kopfes am Ohr in Richtung der Oberseite des Halses. Dies sollte ein gelehrt Hautoberfläche über die Nasenhöhle bieten und Injektion zu erleichtern. </li><li> Setzen Sie die Nadel durch den oberen Teil der Nasenhöhle ca. 3mm unter der Hautoberfläche auf die Riechschleimhaut erreichen. Microinject 0.5μL Virus-Lösung pro Schuss, der Wahl zwei Standorte pro Seite, links und rechts (vier Injektionen insgesamt pro Maus = 2μL des Virus erforderlich). Die Injektionsstelle sollte voneinander versetzt werden. Für die Ausrichtung der richtigen Injektionsstellen, Suche dorsalen Schädel Oberfläche für den Umriss der Riechkolben. Diese Linie ist kaum sichtbar bei der Geburt durch die semi-transluzente Haut und Schädel. Um zwei Injektionen pro Seite, Ziel einer Injektion nur rostral einer Lampe Umriß einer medialen Achse. Nehmen Sie die zweite Insertion lateral um die Birne skizzieren, aber achten Sie darauf, die Injektion medial, so dass Sie kann das olfaktorische Epithel, ventral liegt unterhalb der Lampe zu erreichen Winkel. Vermeiden Sie durchdringen den Riechkolben! </li><li> Trocken tupfen restliche Virus-Lösung oder Blut, das von der Injektionsstelle oder Nasenlöcher mit einem Kimwipe entweichen kann. Unmittelbar von Kimwipes verfügen in der verdünnten Lauge den geltenden Bestimmungen. </li><li> Legen Sie die injizierten Maus auf das Wasserbett Inkubator. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1-4 für alle Mäuse injiziert werden, erinnern Sie über 2μL Virus-Bestand pro Maus benötigen. </li><li> Lassen Mäuse auf dem Wasserbett Inkubator für 30 Minuten erholen, bevor sie wieder in ihre ursprüngliche Verschachtelung Käfig. </li><li> Entsorgen Sie die Mikroinjektion Bühne, desinfizierende Tücher und keine zusätzlichen Reinigungs-Papier-Produkte in der Lauge biohazard Verfügung. </li><li> Reinigen Sie die Hamilton-Spritze durch mehrmaliges Ansaugen und Ausstoßen von Ethanol und dann mit Wasser, wie in der vorbereitenden Schritte getan. Lassen Sie die Spritze, um zu trocknen. </li><li> Für maximale Transduktionseffizienz wiederholen Sie diesen Vorgang wieder in 4 Stunden. Infizierte OSNs kann über die gesamte Länge der Zelle sichtbar gemacht werden, in nur drei Tagen. </li></ol> 3. Immunhistochemie von schwimmenden Riechkolben Abschnitte <ol><li> Sacrifice das injizierte Maus auf den gewünschten Zeitpunkt und Perfusion fix das Gewebe mit 4% Paraformaldehyd. Sezieren die OB. Inkubieren in Paraformaldehyd über Nacht und dann 30% Saccharose in PBS über Nacht. Embed in OCT Einbettmedium auf Trockeneis. </li><li> Koronare OB Abschnitte werden mit einer 60 um Dicke mit einem Kryostat erhalten. Sweep Glühbirne Abschnitte in einen 10cm Kulturschale mit 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Die Schnitte werden schwimmend gehalten in PBS, um OAT d ermöglichenissolve. Transfer schwimmenden Abschnitte und PBS in ein 50ml-Fläschchen konisch. </li><li> Lassen Abschnitte auf den Grund des Fläschchens zu begleichen. Absaugen PBS ohne Ansaugen alle Abschnitte. Spülen Sie Gewebeschnitte mit 20ml PBS. Wiederholen Sie absetzen und Staubsaugen Schritte. Resuspendieren Gewebe mit 10 ml PBS und Transfer schwimmenden Abschnitte, um eine 15 ml konische Röhrchen für Immunfärbung. Sobald Gewebeschnitten niedergelassen haben, absaugen PBS Überstand ohne störende Gewebe. Resuspendieren Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) ermöglicht Reinigungsmittel Zellmembranen zu perforieren. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und wiederholen Inkubation mit PBS-Tx zweimal. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte in 10 mL Blocking-Lösung (5% Pferdeserum in PBS-Tx) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Blockierungslösung mindestens zweimal mit PBS-Tx für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie 2 ml eines primären Antikörper-Lösung in PBS-Tx. Siehe Reagenzien und Geräte Abschnitt für Antikörper in diesem Experiment verwendet. </li><li> Ersetzen zweite PBS-Tx blockiert abwaschen mit primärer Antikörper-Lösung. Inkubieren auf einem langsam Wippschüttler (~ 30rpm) bei 4 ° C für 24-48 Stunden, um gründliche Eindringen in den 60 um schwebende Abschnitte zu gewährleisten. </li><li> Nach der Inkubation kann der primäre Antikörper-Lösung abgerufen vorsichtig mit einer Pipette und Lagerung bei 4 ° C für die Wiederverwendung von bis zu zwei weitere Male innerhalb von zwei Wochen ohne nennenswerten Verlust an Intensität der Färbung. </li><li> Wash Schnitte dreimal in PBS-Tx für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Drehen (~ 30rpm). </li><li> Bereiten Sie 2 ml des sekundären Antikörper-Verdünnung in PBS-Tx. Saugen Sie die letzte Waschung und fügen sekundären Antikörper-Lösung auf Gewebeschnitten. Wickeln Sie das außerhalb der Färbung Fläschchen in Aluminiumfolie ein, um Licht, das Fluorophor Ausbleichen führen kann blockieren. Legen Sie wickelte Durchstechflasche auf einer langsam Wippschüttler und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Discard sekundären Antikörper-Lösung durch Absaugen entfernt. Wash Abschnitte einmal mit PBS-Tx für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie zwei weitere Male mit PBS (pH 7,4) für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Montieren Sie die gefärbten Gewebeschnitten auf Glas-Objektträger mit Fluoromount G. </li><li> Bildschirm durch gefärbten Schnitten für positiv infizierten OSN Axone und Axon-Terminus mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. </li><li> Zur Konstruktion eine dreidimensionale Ansicht eines markierten OSN Axon und Terminal-Laube, machen eine Reihe von optischen Schnitten durch die 60 um Tiefe des Ziels OB Gewebeschnitt (entlang der z-Achse) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. </li><li> Dieser Stapel von Z-Abschnitt Bilder können anschließend gemeinsam projektiert werden, um eine 360 ​​° drehbaren Perspektive eines einzelnen markierten OSN Axon, einschließlich Terminal Laube Detail in allen ihren Teilen zu rekonstruieren. Jeder einzelne Drehwinkel erfasst und exportiert werden als Bilddatei (zB JPG, TIFF) für 2D-Format Präsentation. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Mit der hier beschriebenen Methoden können wir Riechzellen durch Lentivirus in vivo transduzieren. Wir haben bisher visualisiert infiziert OSNs mit GFP und mCherry fluoreszierenden Reporter, als auch mit einem myc-Tag-Fusionsprotein über Immunzytochemie. Diese Technik bietet eine Fülle von infizierten OSNs. Dennoch tritt Transduktion sporadisch genug, um individuell beschriftet OSNs bieten, so dass für die Analyse der einzelnen Zelle Morphologie. Axone und Axon-Terminals sind in OB Gewebeschnitten inmitten ihrer natürlichen Umgebung durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) abgebildet. Die gesamte OSN Axonterminal Laube kann in der Regel innerhalb einer 40-50 um optischen Schnitt begeistert sein. Hohe Vergrößerung der infizierten OSN Axonterminalen ermöglicht eine detaillierte Analyse der axonalen Laube Morphologie an der glomerulären Schicht. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flugbahn der einzelnen Riechzelle Axon und seinen Anschluss Laube. A) A Frontalschnitt der Riechkolben einer P7-Maus, die den olfaktorischen Nerv Schicht (ONL) immungefärbt für OMP (rot) und der glomerulären Schicht (GL) immungefärbt sowohl mit OMP und VGLUT2 (grau). Ein einziger Riechzelle Axon, die GFP (grün) reist in den ONL und dringt in die glomeruläre Struktur. B) Die Axonterminal Laube Morphologie innerhalb der Glomerulus deutlich GFP-Expression hervorgehoben. VGLUT2 Co-Färbung in grau leuchtet die gesamte glomeruläre Bereich, in dem die GFP-positive Axon erarbeitet ein Terminal Abtreibung. C) Lentivirale infiziert OSNs, die GFP (grün) in der OE. Die cytostructure des olfaktorischen Epithels ist mit DAPI-Färbung (blau dargestellt). GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von OSN Zellkörper und ihre zelluläre Prozesse in der OE. D) Ein OSN Axon und seinen Anschluss Morphologie mit Rap1GAP2 Ausdruck knock-down von shRNA. Lentiviren tragen eine doppelte Expressionskassette mit Rap1GAP2 shRNA unter der Maus U6-Promotor und GFP unter einemCMV-Promotor wurden die OE angewendet. Infizierte olfaktorischen Axonterminalen zeigte einen vereinfachten Anschluss Laube, wenn der der GFP nur Kontrolle verglichen. Bar = 20 um.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Dieses Protokoll ist bio-Sicherheitsstufe 2 konform. Alle geeigneten Arbeitsplatz, persönliche Schutzausrüstung und virale Abfallstoffe Maßnahmen wurden entsprechend eingerichtet. Alle tierischen Verfahren wurden nach IACUC Leitlinien durchgeführt.

Mikroinjektion von Lentivirus führt zu einer dauerhaften Übertragung von Gen-Konstrukten in OSN genomischer DNA. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, kurzfristige oder langfristige Manipulationen von Kandidatengenen über Überexpression oder shRNA vermittelten knock-down durchzuführen. Darüber hinaus können wir Fluoreszenz-Label einzigen OSNs in eine vorhandene transgene Maus Linie Co-Lokalisation von Geruchsrezeptoren Populationen zu beobachten. Mikroinjektion ist für lentivirale Transduktion OSNs erforderlich. Wir...

Mikroinjektion: Neugeborene Mäuse wurden mikroinjiziert mit einem 5μL Hamilton-Spritze (Hamilton # 7647-01) mit einer 33-Gauge-Nadel (Hamilton # 7762-06) ausgestattet. Immunocytochemistry Reagenzien: Primärantikörper: polyklonalen Kaninchen-Antikörper GFP (Molecular Probes # A-6455), Huhn polyklonalen Antikörper gegen OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Meerschweinchen polyklonalen Antikörpers gegen VGLUT2 (Millipore # AB2251). Sekundärantikörper: Cy2-konjugierten Esel-anti-Kaninchen (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-konjugierten Esel-anti-Huhn (Jackson Immunolab # 703-165-155) und Cy5-konjugierten Ziege anti-Meerschweinchen (Jackson Immunolab # 106-175-008). Die Schnitte wurden auf Glasplättchen mit Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) mit 50ng/mL DAPI Chromatin Färbelösung montiert. Konfokale Bildgebung: Z-Stapel-Aufnahmen wurden mit einer Olympus Flouview FV1000 konfokalen Mikroskop und Bilder gesammelt und in 3D-Projektionen mit Olympus FV10-ASW 2,01 konfokale Erfassung und Analyse-Software verarbeitet.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltung basiert auf präzisen Projektion Riechzelle (OSN) Axone ihre synaptischen Ziele im Riechkolben (OB). Die molekularen Mechanismen der OSN Axonwachstum und Targeting sind nicht gut verstanden. Manipulation der Genexpression und die anschließende Visualisierung der einzelnen OSN Axone und deren Terminal Laube Morphologie haben bislang eine Herausforderung. Zur Untersuchung der Genfunktion in der einzelnen Zelle Ebene innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens, entwickelten wir eine lentivirale basierende Technik, um die Genexpression in OSNs in vivo zu manipulieren. Lentivirale Partikel werden OSNs durch Mikroinjektion in die olfaktorischen Epithels (OE) geliefert. Expressionskassetten sind dann permanent in das Genom der transduzierten OSNs integriert. Das grün fluoreszierende Protein-Expression identifiziert infiziert OSNs und skizziert ihre gesamte Morphologie, einschließlich der Axonterminal Laube. Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Mikroinjektion und Reporter-Erkennung kann Genfunktion Studien in einem sehr engen Zeitraum der Entwicklung konzentrieren. Mit dieser Methode haben wir die GFP-Expression innerhalb von nur 3 Tage erkannt und so lange wie 3 Monate nach der Injektion. Wir haben sowohl Überexpression und shRNA vermittelten knock-down von lentiviralen Mikroinjektion erreicht. Diese Methode liefert detaillierte Morphologien der OSN Zellkörper und Axone an der einzelnen Zelle Ebene in vivo, und ermöglicht damit die Charakterisierung der Kandidaten-Gen-Funktion während olfaktorischen Entwicklung.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung In vivo.

Serie: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.