Die Autoren möchten sich dank Mitglieder des Houston-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts wie. Forschung wird durch die National Institutes of Health (GM083999) verliehen DWH unterstützt

1. Chirurgische Entfernung von Eierstockgewebe <ol class="lalpha"><li> Bereiten Sie eine neue Charge der Eizelle Kulturmedium (OCM; Materials), zwischen 400-800 ml, je nach Größe des Experiments. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6-7,8, bis die Phenolrot wird eine dunkelrote Farbe (sechs oder so kleine Tropfen von 5N NaOH). Gieße eine kleine Menge auf den pH-Wert in einem separaten Röhrchen zu überprüfen, da der pH-Elektrode den Medien verunreinigen können. OCM sollte bei 18 ° C gelagert werden und innerhalb von einer Woche. </li><li> Wählen Sie 3-5 Weibchen und Platz eins in ~ 2L gepuffert Anästhesielösung (Materials). Wir versuchen zu vermeiden, mit Fröschen, die am Tag der oder vor der Operation zugeführt wurden. Während der Frosch auf die Narkose verfallen ist, desinfizieren Sie die OP-Bereich mit 70% EtOH und bereiten die chirurgischen Instrumente. </li><li> Sterilisation der chirurgischen Instrumente, die von 20-Sekunden Eintauchen in eine heiße Perle Sterilisator bei 250 ° C. Die folgenden Instrumente sollten zur Hand sein: Skalpellgriff (# 3) und Klinge (# 10 oder 11), mehrere Paare von Dumont Pinzetten, Bonn Iris Schere (gebogene oder gerade), Halsey und Olsen-Hegar Mikro Nadelhalter und Nahtmaterial. Legen Sie sterilisierten Instrumente auf einer sterilen Petrischale oder auf der Innenseite der Naht-Paket zu halten steril. Fassen Sie die Nadel in den Nadelhalter in der gewünschten Orientierung vor Beginn. Wir bevorzugen Olsen-Hegar Nadelhalter seit den Griff enthält Scherenblätter, die verwendet werden, um Nähte ohne Umschalten Instrumente trimmen können. </li><li> Nach 10 Minuten prüfen, ob ein chirurgischer Ebene der Anästhesie erreicht wurde. Narkotisierten Fröschen wird nicht mehr bewegen und nicht an einer Zehe Prise reagieren oder sich umgedreht. Anästhesie sollte letzten 15 Minuten, was mehr als genug Zeit, um die Operationen durchzuführen. Don geeignete chirurgische Kleidung. Dazu können auch saubere Handschuhe (non-latex), Kittel und OP-Masken, je nach persönlicher Vorliebe und institutionelle Tierpflege Richtlinien. </li><li> Hinweis zur aseptischen Bedingungen: Frog Hautabsonderungen enthalten antimikrobielle Peptide, die im Allgemeinen Verringerung der Inzidenz von Kontamination während der Operation, obwohl aseptischen Bedingungen so weit wie möglich befolgt werden sollten. Operationsabdecktücher kann verwendet werden, dürfen aber nicht durch institutionelle IACUCs erforderlich sein und dürfen nicht bieten viel profitieren. Generell &quot;Spitze-Technik&quot; eingesetzt, wo die Hände der sterilen Spitzen der Instrumente, Nahtmaterial oder Inzisionsstelle berühren. Instrumente können resterilisiert (in der Perle Sterilisator) werden folgende Inzision der Haut und einer sterilen Bereich sollte auf dem Labortisch für die Platzierung Instrumente (wie eine Petrischale oder Naht-Paket) beibehalten werden. Institutionelle Anforderungen können erheblich abweichen, so folgen Sie bitte Ihre Institutionen Richtlinien und eine angemessene Unterweisung vor der Durchführung Operationen. </li><li> Entfernen Sie den Frosch aus Anästhesie und in Rückenlage auf einer feuchten chirurgischer wischen. Hinweis. Die Haut kann durch Spülen in verdünnter Povidin Jod (1:20) oder Chlorhexidin (0,75%) gereinigt werden. Vermeiden Sie jedoch kommerziellen chirurgischen Peelings, Seifen und 70% Isopropylalkohol, da diese die empfindliche Haut der Amphibien führen. </li><li> Mit einem Skalpell oder kleine Iris Schere, einen kleinen (1 bis 1,5 cm) Schnitt in der Haut im unteren Teil des Bauches, lateral der Mittellinie. Nachfolgende Einschnitte auf dem gleichen Frosch wechselseitig durchgeführt werden sollte, gut voneinander entfernt. Einschnitte können entweder parallel oder senkrecht zur Mittellinie erfolgen. </li><li> Nehmen Sie die Haut und Bauchmuskeln Einschnitte in zwei Stufen. Nach dem Schneiden der Haut, heben Sie die Muskelschicht und Umgebung weiß gefärbte Faszie mit einer Pinzette und machen den Schnitt in der erhöhten Muskel. Mit einer Schere und schnitt gerade nach unten, versuchen, mit einer schnellen Schnitt in die Leibeshöhle verlassen saubere Wundränder aussetzen. Wenn nur die Faszie geschnitten wird, wird es zurückgezogen und macht Nähen schwieriger. Lifting der Muskel hilft nicht versehentlich verletzt keine inneren Organe. Versuchen Sie auch, zu vermeiden Schneiden durch sichtbare Lymphherzen oder Blutgefäße innerhalb der Muskelschichten. Verlängern Sie die Länge mit der Schere des Schnittes, so dass Eierstock leicht herausgezogen kann durch sein. </li><li> Eierstock muss deutlich sichtbar sein, wenn der Schnitt gemacht. Zu beschaffen Eierstock, mit einer Pinzette fassen und externalisieren die Eierstockgewebe. Die gewünschte Menge an Gewebe entfernt ist, und getrimmt off auf der Ebene des Körpers Wand. Nicht Zeug das Gewebe wieder in die zölomischen Hohlraum, da dies eine Quelle der Infektion oder andere Komplikationen auftreten könnten. </li><li> Unmittelbar beobachten ein kleines Stück Eierstock unter einem Binokular und defolliculate ein paar Eizellen, um ihre Qualität zu testen. Sie sollten fest sein und eine einheitliche Größe und Färbung. Wenn sie akzeptabel sind, entfernen Sie die gewünschte Menge Eierstockgewebe und Naht des Schnittes. Genug, um eine 90 mm Petrischale füllen ist in der Regel ausreichend für die meisten Experimente. Wenn die Eizellen von fragwürdiger Qualität sind, Naht der Frosch, und wiederholen Sie mit einer anderen Frau. </li><li> Schließen Sie den Schnitt durch Naht der Muskeln und Faszien Schicht zuerst. Legen Sie die n<html> eedle wenige Millimeter lateral der Inzision, achten Sie darauf, durch die Faszie Schicht als auch weitergeben. Nahtmaterial nur durch den Muskel reißen das Gewebe und lösen kann. Verwenden einer Pinzette, um die Nadel von unten auf der gegenüberliegenden Seite des Schnittes. Release and re-fassen die Nadel von außerhalb des Körpers und ziehen Sie den Faden durch, bis mehrere Zentimeter oder so der Schwanz bleibt, kümmert sich nicht um ziehen Sie den ganzen Weg durch. </li><li> Schließen Sie die Wunde mit einem einfachen unterbrochen Muster der Naht. Wir verwenden ein grundlegendes Instrument Bindung an Chirurgen quadratischen Knoten (Riff Knoten) zu machen. Schleife das lange Ende des Fadens um den Nadelhalter, fassen Sie den Schwanz und ziehen Sie es durch die Schlaufe in Richtung zu Ihnen und zu straffen. Loop und ziehen wieder durch, ziehen Sie dieses Mal den Nadelhalter von Ihnen entfernt. Eine dritte werfen kann für zusätzliche Sicherheit verwendet werden (in die gleiche Richtung wie die erste). Schneiden Sie die Naht, so dass kurze Schwanz und das andere tun Naht in den Muskel ein paar Millimeter entfernt. Zwei Nähte sind ausreichend für kleine Nähte, drei für größere. Wiederholen Sie dies für die Hautschicht. Video-Demonstrationen von grundlegenden Nahttechnik sind auf YouTube - Suche nach &quot;Instrument tie&quot;, es gibt durchaus ein paar zur Auswahl, obwohl die grundlegende Technik ist die gleiche. </li><li> Spülen Sie das Weibchen mit deionisiertem Wasser und legen sie in eine Erholung Eimer mit kaltem (18 ° C) Wasser gefüllt. Während im Labor, sind die Frösche in Leitungswasser mit Amquel behandelt, um Chloramine zu entfernen gehalten. Alle paar Minuten, heben den Frosch aus dem Wasser und suchen Sie schlucken oder ins Auge prall Bewegungen, was auf aus der Narkose. </li><li> Hinweis: Survival Chirurgie ist nicht unbedingt notwendig, Eierstockgewebe erhalten, obwohl die Weibchen weiterhin gute Eizellen nach einer Reihe von Operationen zu erzeugen. Performing Überleben der Operation wird auch reduzieren auf die Anzahl von Tieren verwendet wird. Achten Sie darauf, Ihr Tier kümmern Einheit Richtlinien an Wirbeltieren Überleben Operationsmethoden, post-op Pflege und Überwachung und für die Anzahl der erlaubten Operationen auf einem einzelnen zu folgen. </li></ol> 2. Anzucht und Defolliculating Oozyten <ol class="lalpha"><li> Gleich nach der Operation beendet ist, unterteilen den Eierstock in kleine Stücke schneiden (ca. 2 cm 2) und speichern in frischen OCM mit 5-6 Stück pro 90 mm ​​Schale. Einzelne Lappen des Eierstocks sind aufgeschnitten, flach ausgeschnitten und in quadratische Stücke. Diese sind in sauberen OCM gespült und in Gerichten für die Kultur. Abflachung und die Aufteilung des Eierstocks wird sein Leben in der Kultur zu erweitern und zu defolliculation einfacher. </li><li> Verschieben eines Lappens in eine kleine Schale der OCM und manuell defolliculate 300-500 Oozyten. Transfer-Oozyten mit einer sterilen, feuerpolierte Pipette. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung der Baumwolle gesteckt Vielfalt ist wichtig für die Minimierung Kontamination der Kulturen. Bewahren Sie die Oozyten bei 18 ° C in 8 mL OCM (in mittlerer Gerichte (Falcon 1007)) in Gruppen von 100-150. Mit etwas Übung sollte es möglich sein, genügend Eizellen in 1-2 Stunden defolliculate. Collagenased Eizellen sind nicht geeignet für Host übertragen, da sie nicht befruchtet werden. </li><li> Defolliculating Methode. Wir defolliculate mit Uhrmacher Pinzetten (Dumont # 4s oder # 5s, Fine Science Tools), im Anschluss an die grundlegenden Methoden in Smith et al. Beschrieben, (1991). Mit einem Pinzette (in Ihrer dominanten Hand), fassen Sie die Theca Bindegewebsschicht um einen ausgewachsenen Stadium VI Oozyten in der Nähe, wo die Follikel der Ovarien (der Stiel) befestigt. Mit der anderen Pinzette fassen Sie den Eierstock benachbart zu dem ersten Paar. Leicht Aufreißen der Follikel-Schicht, indem Sie über die Eizelle. Gently necken die Eizelle aus dem Gewebe. Erfolgreich defolliculated Eizellen floppier als Eizellen einfach abgezogen, ohne die Follikel Schicht und wird frei von sichtbaren Blutgefäße. </li><li> Hinweis: Es ist wichtig, sehr leichten Druck auf die Spitzen der Pinzette zu halten, kaum genug für die Tipps zu erfüllen. Greifen zu eng ist eine häufige bei Anfängern und wird in die Eizelle weggezogen mit dem Follikel intakt führen. Halten Sie eine gute Pinzette ausschließlich für defolliculating. Die Spitzen sollten exakt erfüllen und sollte etwas stumpfer als Zange zur Herstellung von Explantaten aus Xenopus Embryonen (Abbildung 1). </li><li> Wir routinemäßig über 20 mit Progesteron und Abbruch des Experiments reifen, wenn die Reifung ist noch niedrig (&lt;50% nach 6-7 Stunden bei Raumtemperatur). </li><li> An diesem Punkt können die Eizellen manipuliert werden und kultiviert wie gewünscht, wie Mikroinjektion von Oligo-, Morpholino-oder mRNA. Injection Verfahren variieren je Lab, so werden wir nicht beschreiben, den Sie hier. Eizellen können bis zu einer Woche in OCM beibehalten werden, aber im Allgemeinen die Gesundheit sinkt so ist es am besten, um sie für die Übertragung innerhalb von 96 Stunden der Isolation zu verwenden. </li><li> Beachten Sie, dass nur fünf bis sechs Gruppen (einschließlich einer Kontrolle), um ein einziges Weibchen übertragen werden können, aufgrund der Beschränkungen, die Vitalfarbstoffen, so planen Sie Ihre Experimente entsprechend. </li></ol>&quot;&gt; 3. Eizellreifung und Stimulation der vorgesehenen Gastgeber Frauen <ol class="lalpha"><li> Wenn der Durchführung einer Rettung von Oligo Erschöpfung, Injizieren Sie Ihr mRNA (in der Regel 50-300 pg RNA) ~ 24-48 Stunden nach der Oligo. Die Oligos werden abgebaut durch diese Zeit und sollte keinen Einfluss auf die injizierten RNA. </li><li> Am Abend vor der Durchführung der Übertragung werden 16 ul von Progesteron-Arbeitslösung (1 mM in EtOH) auf Eizellen in 8 mL OCM in mittel-Gerichte (final Progesteron-Konzentration ist ~ 2 pM). Inkubieren 10-12 Stunden bei 18 ° C für Eizellreifung zu ermöglichen. </li><li> Inject 3-5 Weibchen mit 1000 Einheiten pro Frosch von hCG zur Eiablage zu induzieren. Unsere Versuche scheinen besser zu funktionieren, wenn Eizellreifung und hCG-Injektion etwa zur gleichen Zeit fertig sind, etwa 12 Stunden vor der Implantation in den Wirt (zB 10.00 Uhr -10 Uhr). Lassen Frauen bei RT oder 18 ° C über Nacht. </li></ol> 4. Vorbereitung und Vital Dye Färben von Eizellen <ol class="lalpha"><li> Am Morgen des Transfers erlauben ~ 45-60 &quot;einzurichten und zu führen Sie das Verfahren. An dieser Stelle können reife Eizellen für eine spätere Analyse der Wirksamkeit von mRNA Zuschlag oder Protein-Expression eingefroren werden. Überprüfen Sie auch, dass die Eizellen noch nicht infiziert werden und dass es eine gute Reifung (&gt; 50%). Infizierte Eizellen nicht befruchtet. Thaw Vitalfarbstoffen (Materials) und Spin bei max Geschwindigkeit für 5 min. </li><li> Farbe der verschiedenen experimentellen Gruppen durch Zugabe von 80 ul der entsprechenden Vitalfarbstoffs (s) zur Eizelle Gerichte und inkubieren mit Schaukeln für 15 &#39;. Während dieser Zeit, wählen Sie einen Host weiblichen und beginnen Anästhesie. Wählen Sie einen Frosch, der sich langsam Verlegung Eier in der Regel oder eine, die reichlich Eier mit leichten Zusammendrücken produziert. Eier aus dem Host sollte von guter Qualität sein. Vermeiden Sie, dass Frauen über Strings von Eiern oder zerkleinert Eier sind. </li><li> Übertragen Sie die bunten Eier, eine große Schale mit frischen OCM, schwenken kurz zu waschen und legen Sie sie beiseite vor der Übertragung. </li><li> Bereiten Sie eine sterile Pasteurpipette mit einer Bohrung gerade breit genug, um eine Eizelle (~ 1,5 mm) für den Einsatz bei der Transplantation von den Eizellen unterzubringen. Ergebnis der Pipette mit einem Diamanten und Bleistift Pause sauber. Feuer polieren, bis die Kanten glatt sind, dabei nicht zu schmelzen die Öffnung geschlossen. </li></ol> 5. Durchführen der Oocyte Transplantation <ol class="lalpha"><li> Oocyte Transplantation verwendet die gleichen Operationen wie in Teil I beschrieben, obwohl anstatt sie zu entfernen Eierstock, manipuliert Eizellen in die Körperhöhle mit einer Pipette eingeführt werden. Idealerweise sollte der Transfer Verfahren so rasch wie möglich durchgeführt werden und die Größe der Inzision sollte so klein wie möglich gehalten werden. </li><li> Anesthesize den Host weiblichen und bereiten chirurgische Instrumente, wie in Teil I beschriebenen Stellen und Anschneiden der Beschreibung in Teil I. Der Schnitt kleiner sein kann, muss aber groß genug sein, um die Bohrung des Transferpipette (Abbildung 2A) passen. </li><li> Um Transplantation der Eizellen, fassen und heben einer Klappe von Muskeln und Faszien mit einer Pinzette und die Einführung der experimentellen Oozyten mit der Pasteurpipette oben hergestellt. Swirl das Gericht von Eizellen, um sie in der Mitte sammeln und saugen so viele wie möglich. Lassen Sie die Eizellen in den Ende der Pipette niederlassen, um überschüssige Flüssigkeit entfernt, gebracht werden und legen Sie die Spitze der Pipette in den Schnitt und langsam damit die Eizellen in den Körper Hohlraum (Abbildung 2B) rieseln. Wiederholen, bis alle Eizellen übertragen wurden. Nicht loslassen der Muskelschicht zu jeder Zeit, bis man begonnen Naht haben, oder die Eizellen werden austreten des Einschnitts. </li><li> Sobald die Eizellen übertragen wurden, erfassen beide Seiten des Schnittes mit einer Pinzette und bringt sie zusammen, so dass die Eizellen in die Körperhöhle zu begleichen. Begin Nähen wie beschrieben, wobei darauf zu achten aufwärts Spannung auf die Muskeln und Faszien zu halten, bis der erste Knoten gebunden ist (Abbildung 2C). Dies wird die Eizellen die Ausstoßung aus zu halten und ermöglicht die Kanten des Schnittes gleichmäßig zu heilen. Add another Naht in den Muskel / Faszien Schicht und dann Naht der Haut. </li><li> Spülen Sie das Weibchen mit deionisiertem Wasser und legen sie in eine Erholung Eimer mit gekühlten (18 ° C) Amquel-behandeltem Wasser gefüllt. Überwachen sie aus der Narkose wie oben. Sie sollten beginnen, Eier zu legen in der Regel nach der Operation. </li><li> Erhalten Hoden eines männlichen Frosches nach den üblichen Verfahren. Bewahren Sie die Hoden in OCM oder L15 bis es gebraucht wird. Wir bevorzugen frische Hoden beim Düngen Transfer-Experimenten. </li></ol> 6. Rückgewinnung von Oozyten und in vitro-Fertilisation <ol class="lalpha"><li> Peritoneal Flimmerhärchen wird die übertragene Eier (und normale zölomischen Eier des Wirtes), um die Öffnungen der Eileiter in die vordere der Körperhöhle zu fahren. Bunte Eier können wiederhergestellt Beginn 2-3 Stunden nach dem Transfer von normalen Quetschen werden. Eier können jede halbe Stunde oder so gewonnen werden, bis das Weibchen nicht mehr über. </li><li> Düngen Sie in einer sperm Suspension (in ca. 4 mL 1x MMR) für 4 Minuten. Flood und spülen Sie ausgiebig mit 0.1x MMR. Eier sollten in der Regel zu aktivieren und zu spalten ~ 1,5-2 Stunden nach der Befruchtung beginnen. Übertragen Eier werden oft spalten etwas später als der Host Eier. </li><li> Entfernen Sie das Gelee Mäntel mit Cystein als normal und Art Embryonen in separate Küche. Dies kann zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, je nach den Bedürfnissen des Experiments. In der Regel am einfachsten, die verschiedenen Farben um den 4-Zellen-Stadium und schwierigsten während der späten Blastula Stadium zu erkennen. Kultur die Eier bei einer geringen Dichte (&lt;50 pro Medium Gericht) in saubere 0.1x MMR. Ab diesem Zeitpunkt können Embryonen behandelt und manipuliert werden in der Regel. </li><li> Bringen Sie die Frösche, die Tierhaltung und Monitor für Komplikationen während der nächsten paar Tage. </li><li> Alternate Befruchtung Methode; Eiablage in Hochsalzpuffer <ol class="lroman"><li> Nach dem Frosch aus der Narkose erholt hat, statt sie in ~ 1L hohem Salzgehalt MMR (1,2 x). Lassen Sie das weibliche Eier in den Puffer legen für ca. 4-6 Stunden. Squeeze restlichen Eier aus, abtropfen lassen 1.2x MMR und sortieren gefärbte Eier in saubere Schüssel; entfernen Sie alle möglichen Flüssigkeit. </li><li> Wash ausgiebig mit 0,3 x MMR und düngen in minimalen Volumen von 0,3 x MMR / Spermiensuspension bis Eiern (10 Minuten) zu aktivieren. Flood mit 0.1x MMR und Kultur wie oben. Diese Option ist nützlich, wenn viele Eier auf der gleichen Stufe oder wenn manuelle Ausdruck von Eiern Schäden des Spenders Eizellen benötigt werden. </li></ol></li></ol>

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. 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L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Iowa IACUC Ausschusses durchgeführt.

Die erfolgreiche Übertragung wird bei der Befruchtung und normale Spaltung von&gt; 50% der Oozyten (Abbildung 3) führen. In der Regel zwischen 30-60% der transferierten Eizellen wird über die Neurula Stadien überleben. Wir in der Regel übertragen 75-150 Eizellen pro Versuchsgruppe, die genügend Embryonen für verschiedene Arten von Analyse Ausbeute (in situ, RT-PCR) sowie die Visualisierung der Phänotyp. Die Implantation wesentlich mehr Eizellen scheint nicht zu einer deutlichen Steigerung der Rendite. Außerdem ...

Lösungen und Rezepte: OCM (Oocyte Kulturmedium; von Wylie et al modifiziert, 1996.) <table border="0"><tbody><tr><td> 70% Leibovitz L-15-Medium (mit L-Glutamin) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x Penicillin-Streptomycin </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Passen Sie auf pH 7,6-7,8 mit 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Machen Sie frische wöchentlich, Lagerung bei 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Modified Marcs Ringer-Lösung;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> auf pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anästhesielösung <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoesäure-ethylester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / L Natriumbikarbonat </td></tr><tr><td colspan="2"> Man löst in Amquel-behandeltem Wasser </td></tr><tr><td colspan="2"> Machen Sie frische wöchentlich </td></tr></tbody></table> Progesteron Aktien <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM Progesteron (Sigma P-0130) in 100% Ethanol </td></tr><tr><td> Verdünnen auf 1 mM in 100% EtOH für eine 500x Lager / funktionierende Lösung </td></tr><tr><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr></tbody></table> Vital Farbstoffe (modifiziert nach Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blue: 0,1% Nilblau A </td><td> (Aldrich 121479-5G) </td></tr><tr><td> Red: 0,25% Neutral Red </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Grün (80 ul blau + 80 ul braun), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 ul blau + 80 ul rot). </td></tr><tr><td colspan="2"> Eine sechste Farbe, Orange (80 ul rot + 80 ul braun), kann auch verwendet werden, ist aber oft nur schwer von braun zu unterscheiden. </td></tr></tbody></table> Die Bestände an Blau, Rot und Braun sind in VE-Wasser in 50 ml Tuben gemacht, inkubiert für 20 Minuten mit Schaukeln und drehte in einer klinischen Zentrifuge. Die Überstände werden in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bei -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Studium der Beitrag der mütterlich vererbten Moleküle frühen Entwicklung Wirbeltieren wird häufig durch die Zeit-und Kostenaufwand notwendig, Mutter-Effekt mutierten Tiere erzeugen behindert. Darüber hinaus werden viele der Techniken zur Überexpression oder Hemmung der Genfunktion in Organismen wie Xenopus und Zebrafisch ausreichend Ziel kritische mütterlichen Signalwege wie Wnt-Signalweg. In Xenopus, kann die Manipulation der Genfunktion in kultivierten Eizellen und anschließend düngen sie diese Probleme zu einem gewissen Grad zu mildern. Die Eizellen werden manuell vom Spender Eierstockgewebe defolliculated, injiziert oder behandelt in der Kultur, wie gewünscht, und dann mit Progesteron stimuliert die Reifung zu induzieren. Anschließend werden die Eizellen in die Körperhöhle ein Eisprung Host weiblichen Frosch eingeführt, worauf sie durch den Host-Eileiter transloziert werden und erwerben Modifikationen und Gelee Mäntel, die für die Befruchtung. Die resultierenden Embryonen können dann auf die gewünschte Stufe angehoben werden und analysiert die Auswirkungen der experimentellen Störungen. Diese Host-Transfer-Verfahren wurde sehr effektiv bei der Aufdeckung von grundlegenden Mechanismen der frühen Entwicklungsphase und ermöglicht eine breite Palette von experimentellen Möglichkeiten nicht in jedem anderen Wirbeltieren Modell-Organismus.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Verfahren zur Düngung<em&gt; Xenopus Oozyten</em&gt; Durch den Host Übertragungsmethode.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

14.5K Aufrufe.  University of Iowa. Verfahren zur Düngung Xenopus Oozyten Durch den Host Übertragungsmethode.

Serie: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...