Wir danken David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) für die Bereitstellung der Baculovirus AcMNPV und für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canada Foundation for Innovation (CFI), die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt .

Teil 1: Herstellung von Xenopus Oozyten für die Mikroinjektion <ol><li> Legen Sie ein kleines Stück (ca. 2 cm) von Xenopus laevis Ovarien in einem 50-ml konische Röhrchen mit 20 ml Kollagenase-Lösung (5 mg / ml Collagenase in Calcium-freier geändert Barths Kochsalzlösung: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wird verwendet, um die Follikelzellen, die die Eizellen umgeben zu entfernen. </li><li> Das Röhrchen auf einem Schüttler-Plattform und Rock sanft (bei 100 RPM) für eine Stunde. Diese variiert mit verschiedenen Chargen von Kollagenase. So nach einer Stunde, eine kleine Probe von Eizellen und untersuchen sie unter einem Binokular. Richtig de-folliculated Eizellen sollten gut voneinander getrennt werden, und es sollte einfach zu einem Glas Nadel in die Eizelle eingefügt werden soll. Wenn die Eizellen nicht ausreichend de-folliculated, sind sie in der Collagenase-Lösung nach links und wieder überprüft alle fünf Minuten. </li><li> Waschen Sie die Oozyten dreimal mit modifizierten Barths Salzlösung (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,5), und übertragen Sie sie eine 100-mm Durchmesser Petrischale mit MBS plus 1% Penicillin / Streptomycin. Die Eizellen sind nun bereit, mikroinjiziert werden. Wenn Mikroinjektion an einem anderen Tag durchgeführt werden, speichern die Eizellen bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Mit einem Binokular, wählen Sie reifen Stadium VI Oozyten für die Mikroinjektion. Diese Eizellen sind groß, mit gutem Kontrast zwischen den schwarzen Tier Hemisphäre und die cremefarbenen pflanzlichen Hemisphäre. </li><li> Übertragen Sie die reifen Stadium VI Oozyten in eine Mikrotiterplatte (Nunc, 10 ul Well-Volumen). Dies sollte sorgfältig durchgeführt werden, mit einem 200-ul-Pipette mit einer Pipettenspitze, die am Ende geschnitten wurde, um ungestört Sog der Eizellen ermöglichen. </li></ol> Teil 2: Mikroinjektion von Xenopus Oozyten <ol><li> Bereiten Sie die Import-Substrat durch Zugabe einer kleinen Menge von 1% Bromphenolblau, um in der Visualisierung von Mikroinjektion Hilfe mikroinjiziert werden. Zum Beispiel, fügen wir 1 ul Bromphenolblau bis 10 ul Substrat. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Streifen Parafilm auf einer 100-mm-Petrischale, und verzichten einen 5-ul Tropfen der Lösung auf dem Parafilm Streifen injiziert werden. </li><li> Füllen eines zuvor kalibrierten Injektionsnadel (durch Ziehen eines 6,6-ul Mikropipette Drummond mit dem Inject + Matic Puller) mit der Lösung injiziert werden. Dafür ist die Mikroinjektor auf Aspiration Modus eingestellt. Zur Kalibrierung der Injektionsnadel zu Punkt markiert auf der Nadel alle 0,5 mm, was einem Volumen von 50 nl entsprechen. </li><li> Für zytoplasmatische Injektion, legen Sie die Spitze der Nadel in eine Eizelle in der pflanzlichen Hemisphäre, sehr nah an das Tier Hemisphäre, bei einem etwa 45-Grad-Winkel. Drehen Sie den Mikroinjektor Einstellung microinject und microinject jeder Eizelle mit 50 nl der Einfuhr Substrat. Der Punkt markiert auf der Nadel werden verwendet, um die Menge an Substrat, das injiziert wurde überwachen. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Oozyten zu einem kleinen (35-mm Durchmesser) Petrischale mit MBS gefüllt und bei Raumtemperatur inkubieren für die gewünschte Zeit (Zeitpunkte sind so die Beobachtung der Import Substrat mit NPCs verbundenen erlauben gewählt; in diesem Fall zwischen 10 und 30 Minuten für Proteine ​​und Viren, die sich aktiv gegen die NPC transportiert werden, dies hängt auch von der Injektionsstelle und die Größe des Proteins / Virus). </li><li> Nach Ablauf der Inkubationszeit abgeschlossen ist, übertragen Oozyten zu einem 4-ml-Glas-Fläschchen mit 2% Glutaraldehyd in MBS und fix über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Teil 3: Präparation des Xenopus-Oozyten <ol><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Oozyten 3-mal mit MBS. </li><li> Transfer-Oozyten zu einer kleinen Petrischale mit wenig Salz-Puffer (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,5) gefüllt. Mit einem Binokular und Sezieren einer Pinzette entfernen Sie die vegetativen Pol aus jeder Eizelle. Es ist sinnvoll, die Eizelle wird mit einer Pinzette seziert zu stabilisieren, während das andere Paar wie eine Schere benutzt wird, um den vegetativen Pol zu entfernen. An dieser Stelle ist es möglich, den Erfolg der Mikroinjektion durch die Anwesenheit von einem blauen Schimmer in das Cytosol zu bewerten. Das Protokoll ist nur für die Eizellen, die erfolgreich waren mikroinjiziert fortgesetzt. Darüber hinaus, wenn die Proben für die EM vorbereitet sind, macht dieser Schritt Dissektion es viel leichter, den Kern zu finden, wenn Trimmen und Schneiden der Proben. </li><li> Fix der sezierten Eizellen wieder mit 2% Glutaraldehyd in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie die seziert Oozyten dreimal mit LSB. </li></ol> Teil 4: Vorbereitung der injizierten Oozyten für Embedding und Thin-Sectioning EM <ol><li> Übertragen Sie die seziert Eizellen, um eine Depression gleiten. Saugen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglichSible, und dann schnell (so dass sie nicht austrocknen) decken die seziert Eizellen mit 2% niedrig schmelzende Agarose. Während die Agarose noch weich ist, verwenden Sie eine Pipettenspitze, die Eizellen von einander zu trennen und dafür zu sorgen, dass jede Eizelle ist nach oben oder nach unten (nicht seitlich). </li><li> Lassen Sie die Agarose auf ca. 10 Minuten erstarren. Nachdem die Agarose erstarrt, verwenden Sie eine Rasierklinge, die Agarose in kleine Stücke, die jeweils eine Eizelle seziert geschnitten. </li><li> Legen Sie die Agarose-embedded Eizellen in einem 4-ml Glasflasche, und post-fix sie mit 1% OsO 4 in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Probe dreimal in LSB. Falls erforderlich, speichern Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht und weiterhin das Protokoll am nächsten Tag. </li><li> Sequenziell dehydrieren die Proben in eine aufsteigende Reihe von Alkohol (50, 70 und 90% Ethanol für jeweils 20 min). Dies wird durch zwei Änderungen in 100% Ethanol für je 15 min folgte. Schließlich dehydrieren Proben mit 100% Aceton für 15 min. </li><li> Infiltrate Proben mit einem 1:1-Gemisch aus Epon (Fluka) und Aceton eine Stunde lang, durch Infiltration mit einem 2:1-Gemisch aus Epon und Aceton für 2 Stunden und schließlich in reinem Epon für mindestens sechs Stunden. </li><li> Ort Proben in flachen Einbettformen mit frischem reinem Epon gefüllt. Die Eizellen werden in so ausgerichtet, dass die Seite des Kerns näher an der Injektionsstelle - in diesem Fall die Seite der Eizellen, die seziert hat - wird im Schnitt zuerst. Dieser Schritt optimiert die Chance der Visualisierung Import der gewählten Substrat. </li><li> Schließlich polymerisieren die Epon für zwei Tage bei 60 ° C. </li><li> Um die Proben zu visualisieren, werden die Blöcke geschnitten und dann geschnitten mit einem Ultramikrotom. Die Schnitte werden auf EM-Gitter, gebeizt mit Standard-Verfahren übertragen und visualisiert mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop. Wir werden uns nicht zeigen, diesen Teil des Protokolls, wie es Standard-EM Prozedur ist. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll erfolgreich gewesen ist, dann ist die Kernhülle (NE) und NPCs muss deutlich sichtbar in EM-Aufnahmen. Je nach Untergrund injiziert und die Zeit zwischen Injektion und Fixierung, sollte das Substrat sichtbar auf der cytoplasmatischen Seite des NPC, in dem NPC, oder an der Kernenergie angesichts der NPC. Abbildung 1 zeigt eine NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus AcMNPV injiziert wurde, bei 4 ° C für 4 Stunden und verarbeitet für die Einbettung und Dünnschliff EM wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Ein Kapsid Andocken an der cytoplasmatischen Gesicht eines NPC ist durch einen weißen Pfeil angezeigt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2 a NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Mit dieser Technik haben wir festgestellt, dass MVM Störungen des NE (Cohen und Pante, 2005) induziert. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="459" /> Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus Ac MNPV injiziert wurde, inkubiert bei 4 ° C für 4 Stunden, und verarbeitet Einbettung und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Kapside sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Abbildung 2" width="600" height="264" /> Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm.

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	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten, Dünn-Schnitte EM kombiniert ist ein hoch effektives Werkzeug für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Dieses System wurde verwendet, um verschiedene Schritte der Einfuhr durch die NPC Karte, z. B. Wechselwirkung eines Kernimport Substrat mit strukturellen Komponenten der NPC wie die zytoplasmatische Filamente und nuklearen Korb (Bewertung von Pante, 2006). Es wurde auch verwendet, um die nukleare Import von Atom-replizierende Viren (Pante und Kann, 2002;...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten von Dünnschicht-Schneiden-Elektronenmikroskopie (EM) gefolgt ist ein ausgezeichnetes System für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Wegen seiner großen Kern und eine hohe Dichte von Kernporenkomplexe (NPCs), kann Kerntransport leicht sichtbar in der Xenopus-Oozyten. Viel Einblick in die Mechanismen der nuklearen Import und Export ist durch den Einsatz dieses Systems (Bewertung von Pante, 2006) gewonnen. Darüber hinaus haben wir die Mikroinjektion von Xenopus Oozyten verwendet, um die nukleare Import Wege von mehreren Viren, die in der Host-Kern replizieren zu sezieren. Hier zeigen wir die cytoplasmatische Mikroinjektion von Xenopus Oozyten mit einem nuklearen Import Substrat. Wir zeigen auch, Vorbereitung der injizierten Oozyten für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte EM, einschließlich Dissektion, Dehydrierung und Einbettung der Eizellen in ein Epoxidharz eingebettet Harz. Schließlich bieten wir repräsentative Ergebnisse für Oozyten, die mit dem Kapsid des Baculovirus Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) oder Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wurden mikroinjiziert, und diskutieren mögliche Anwendungen dieser Technik.

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Hier zeigen wir zytoplasmatische Mikroinjektion<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen mit einem nuklearen Import Substrat, sowie die Vorbereitung der injizierten Eizellen für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte Elektronenmikroskopie.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Hier zeigen wir zytoplasmatische Mikroinjektion Xenopus laevis Eizellen mit einem nuklearen Import Substrat, sowie die Vorbereitung der injizierten Eizellen für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte Elektronenmikroskopie.

Serie: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Forschung

Biologie

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...