Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Forschung bis Blindness (Career Development Awards zu MEZ und ASV und einen nicht zweckgebundenen Zuschuss an das Department of Ophthalmology), die E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ und ASV) und der National Eye Institute / NIH (MEZ Prevent unterstützt gewährt R01EY015748 und R01EY017964).

Teil I. Set-up für die ACT-Test <ol><li> Generieren capped RNA für die Injektion, wie vom Hersteller empfohlen, mit ihren Phenol: Chloroform Reinigungsverfahren (z. B. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA kodierend für ein fluoreszierendes Protein wird als Tracer verwendet. Wir transkribieren entweder gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) oder mCherry 5 cDNA, die in einem pCS2 + Expressionsvektor ist. </li><li> Pull Borosilikatglas Kapillarröhrchen zu konischem Tipps mit einer Mikropipette puller bilden. Wir verwenden Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Machen sterilen Lösungen in Tabelle 1 aus einer 10 X Marcs Geändert Ringer (MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl; auf pH 7,5 eingestellt, autoklaviert und gelagert bei RT). </li><li> Isolieren Hoden von einem männlichen Frosch und speichern das Gewebe bei 4 ° C in einer sterilen Lösung von 1X MMR / Gentamicin (50 ug / mL Gentamicinsulfat; BioWhittaker, Kat. Nr. 17-518Z). Dies kann bis zu einer Woche vor dem Start des Experiments durchgeführt werden, aber es ist verliert seine Wirksamkeit im Laufe der Zeit. </li><li> Eiablage-Lösung (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma Basis, 2,62 mM NaHCO 3 und 2,75 mM MgSO 4, eingestellt auf pH 7,6) kann als ein 8X Lager getroffen werden, die kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Hinweis: Achten Sie auf Kontamination in dieser Lösung, da dies die Qualität der Eier beeinflussen. </li><li> Generieren Injektion Platten. Um dies zu tun, schmelzen 1% Agarose in 0,4 x MMR in einer Mikrowelle, add ~ 6 ml geschmolzener Agarose-Lösung in 60 mm Platten, sanft abrollen ein Elastomer Form (Abbildung 1) auf der Oberseite der Lösung, um Blasen zu verhindern, und lassen Sie für etwa kühlen 20 Minuten bei RT. Zur Bestimmung der Anzahl benötigt, sollten Sie die Anzahl der experimentellen Bedingungen (z. B. 1, YFP, 2, YFP + Noggin) und die Zahl der transplantierten Host Embryonen benötigt werden. Für unsere Experimente zu generieren wir mindestens 20 transplantierten Host Embryonen für jeden experimentellen Zustand. Bei 18-19 ° C, Embryonen im Stadium 15 für etwa eine Stunde sein. Wenn es eine Stunde dauert bis 20 Transplantationen durchführen, dann zwei Befruchtung Zeitpunkten benötigt werden, vorausgesetzt, der Host-Embryonen akzeptieren alle Transplantationen. Daher wird mittels vier Injektionen verabreichter Gerichte benötigt (2 exp Bedingungen x 2-Düngung Zeitpunkte = 4). Lagern Sie die Platten bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Generieren Kappe Isolation Platten mit 1% Agarose + 0,7 X MMR mit Formen wie bei der Injektion Platte. Machen Sie die gleiche Anzahl von Cap isoliert als Injektion Platten plus eine extra pro Befruchtung Zeitpunkt (4 + 2 Befruchtung Zeitpunkten = 6). </li><li> Inject Weibchen mit 500 Einheiten humanes Chorion-Gonadotropin spät in den Tag, an dem Tag vor der Mikroinjektion. Shop Frauen bei 16-18 ° C über Nacht. </li></ol> Part II. RNA Mikroinjektion von Xenopus laevis Embryonen A. Vorbereitung für die Mikroinjektion <ol><li> Entfernen Sie hormonell induzierten weiblichen und legen Sie sie in einzelnen Tanks mit 1X Eiablage Lösung (ELS). Hinweis: wir verwenden keine Eier, die in der ELS mehr als zwei Stunden wurden die Qualität der Eier wird reduziert. Deshalb etwa eine Stunde vor in-vitro-Fertilisation, verwerfen wir alle Eier aus dem Tank, so dass nur frisch gelegten Eier gesammelt werden. </li><li> Bereiten Sie die Nadel für die Mikroinjektion von Schnippeln von der Spitze zu einem 25-35 Mikrometer Durchmesser zu erhalten. Setzen Sie die Nadel auf die picoinjector und kalibrieren, so dass es 10 nL verzichtet pro Injektion. </li><li> Set einem Inkubator auf 14 ° C. </li><li> Sobald Weibchen Eier für etwa eine Stunde, entfernen Sie die Eier aus dem Tank mit einer Transferpipette und sie in 60 mm Petrischalen gelegt. Entfernen Sie so viel ELS aus den Eiern wie möglich und ersetzen mit 1X MMR. Die Eier können sofort befruchtet werden oder bleiben in 1X MMR für bis zu eine Stunde. Für die Transplantation Assay ist es am besten, zwei Gerichte, 80% voll aus einer einzigen Schicht von Eiern in bis zu drei getrennten Ansätzen gegen 11 Uhr, mittags und 01.00 Uhr zu befruchten. Nach der Injektion wird sie bei 14 ° C platziert werden, so dass sie auf die gewünschte Bühnen für cap Trennung (Stufe 8,5-9) und Transplantation wachsen (Stufe 15; siehe Teil I, Nr. 6 oben). </li><li> Zur Überprüfung der Qualität der Hoden führen wir einen frühen Morgen-Fertilisation (~ 08.00 Uhr), die uns Hoden von einem anderen männlichen extrahieren, wenn die Spermien aus dem ersten ist nicht lebensfähig ermöglicht. Hinweis: Wir homogenisieren ~ 0,25 Hoden in 1 ml 1X MMR und fügen etwa 5 bis 7 Tropfen pro Platte von Eizellen. </li><li> In-vitro-Befruchtung der Eier mit homogenisiert Hoden und eine Stunde später, entfernen Sie das Gelee Mantel auf die Eier mit de-Gelee-Lösung (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 bis 50 ml autoklaviert Nanopure Wasser). Warten Sie, bis sie zwei-Zell-Stadium zu sortieren, die etwa 2 Stunden dauert bei 18 beginnen ° C erreichen oder 1,5 Stunden bei Raumtemperatur (22 ° C). </li><li> Mit einem transfer Pipette Art gleichmäßig pigmentierte und gleichmäßig geteilt Embryonen, wie in der linken Tier Kappe in Abbildung 3 dargestellt, in den Brunnen einer Injektion Gericht mit 0.4x MMR + 6% Ficoll gefüllt. </li></ol> B. Mikroinjektion <ol><li> Stretch Parafilm über die Spitze eines 60 mm-Petrischale Deckel. Pipette 2 ul Ihre erste RNA-Probe auf den Parafilm und saugen mit den PLI-100, um Ihre Injektionsnadel zu füllen. Achten Sie darauf, um zu überprüfen, dass die Nadel immer noch Dosieren 10 nL der Probe vor dem Start Injektion. </li><li> Inject 20-30 Zwei-Zell-Embryonen (beide Blastomeren) mit 500 pg YFP RNA in eine Schüssel und Ihr Gen von Interesse (zB 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA in eine andere Schüssel sieben. </li><li> Legen 100-200 nicht-injizierten Embryonen pro Zeitpunkt in eine weitere Injektion Schale mit der Ficoll-Lösung. Bewegen Sie sie in und aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die injizierten Embryonen. Dies sind die Gastgeber in Teil IV verwendet werden. </li><li> Nach der Injektion inkubieren alle Embryonen bei 14 ° C über Nacht. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte. </li></ol> Teil III. Isolieren tierischer Kappen aus injizierten Embryonen <ol><li> Kommen Sie früh am Morgen, um die Embryonen der Bühne. Der früheste Zeitpunkt sollte in Stufe 9 sein. Entfernen Sie diejenigen, die nicht überlebt haben. Gehen Sie mit den folgenden Schritten die Arbeit mit jedem Zeitpunkt in den Reihen. </li><li> Abgießen Ficoll-Lösung von jeder Platte und wieder hinzuzufügen 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Um eine Kappe Isolation Schüssel, fügen Sie eine großzügige Menge 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Verdrängen Embryonen aus der Injektion Gericht Brunnen mit einer Transferpipette und in den frisch präparierten Kappe Isolation Gericht. </li><li> Isolieren tierischer Kappen in 0.7X MMR + Gentamicin-Lösung, halten 2 oder 3 intakte Embryonen für die Inszenierung. Entweder die Gastromaster, mit einer gelben Spitze gebogen, um 400 um, oder ein Paar scharfe Nummer 5 Zangen ausgerüstet verwendet werden kann. </li><li> Put Kappen zurück in 14 ° C Inkubator bis zum nächsten Tag. Der Host-Embryonen aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die Kappen, sie auf der gleichen Entwicklungsstufe wie das Spendergewebe halten entfernt werden. </li></ol> Teil IV. Die Transplantation von Kappen auf Flanke <ol><li> Entfernen Sie die Schutzkappen und Embryonen aus dem ersten Zeitpunkt aus dem 14 ° C Inkubator und Bühne der Embryonen. Sortieren für eine einheitliche gelbe oder rote Fluoreszenz-positive Mützen, abhängig von der Tracer (Abbildung 2). </li><li> Zählt die Anzahl der Kappen und entfernen Sie doppelte Anzahl der Bühne 12-13 Embryonen ein frisch zubereitetes Injektion Gericht mit 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Mit scharfen Nr. 5 Pinzette entfernen die Dotterhaut von jedem. Übertragen auf die Platte mit dem Deckel, aber seien Sie vorsichtig. Ohne ihre vitelline Membranen können Embryonen schnell an der Oberfläche des Wassers zu distanzieren. </li><li> Mit dem gastromaster (gelber Spitze, 200-250μm gebogenen Draht, höchste Einstellung) oder Nr. 5 Zange, entfernen Sie einen 200 um Platz auf der Seite des Embryos im Stadium 14-15 (Abbildung 3). Dann schneiden Sie ein Cap in die Hälfte (mit dem gastromaster oder Nr. 5 Pinzette) und platzieren Sie das Gewebe in das Loch in der Host-Embryo gemacht. Drehen Sie den Embryo gegen die gut zur Heilung zu ermöglichen. Tun Sie dies für so viele Embryonen, wie Sie können, während sie bei Stufe 15 sind. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte. </li><li> Der Embryo wird in der Regel innerhalb von 30 Minuten zu heilen. Entfernen Sie die toten Zellen (weiß) mit einem sanften Bürsten Bewegung mit einem # 5 Pinzette. Wachsen sie bei 18 ° C über Nacht. </li><li> Unter dem Sezieren Fluoreszenzmikroskop, sortieren Embryonen mit fluoreszenzmarkierten, transplantierte Gewebe. Setzen Sie sie wieder bei 18 ° C bis Stufe 42-43 wachsen. </li><li> Anesthetize die Tiere in Tricaine. An dieser Stelle können Sie Bilder unter einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop nehmen. Nachdem Sie fertig sind, zu beheben, Abschnitt und immunostain oder in situ-Hybridisierung mit Markern für Ihre Gewebe von Interesse durchzuführen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Design aus Plexiglas für das Gießen der Elastomer-Form zur Herstellung Embryo hält Speisen verwendet. Ein 38 x 38 mm mit abgerundeten Ecken square (~ 5 mm tief) wurde aus einem Stück Plexiglas, das 50 x 50 mm ² und 25 mm dick ist geleitet. Circular, gleichmäßig verteilte Bohrungen (1,5 mm Durchmesser) wurden 1 mm tief in den Kunststoff gebohrt. Um das Elastomer Form für die Mikroinjektion Gerichte, gossen wir Sylgard Elastomer in den Plexiglas und erlaubt es sich zu verfestigen, wie pro Anweisungen des Herstellers. Dieses Elastomer Form wird verwendet, um Einspritzung und Kappe Isolation Platten zu machen. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Tierische Kappe Sortierung vor der Transplantation ist es wichtig, als Ausdruck variieren kann. Tierische Kappe auf der linken Seite drückt mCherry gleichmäßig über das Gewebe, das Explantat auf der rechten Seite hat spotty Ausdruck und werden verworfen. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine Vielzahl TADPole hat ein Auge-Struktur auf ihrer Flanke von transplantierten Tieren cap-Zellen entwickelt. Ein fluoreszierendes Bild auf dem Hellfeld Bild wurde überlagert.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

In diesem Video haben wir unsere Version des klassischen Techniken, die von Xenopus Biologen, die wir neu geordnet, um das Tier Kappe Transplantation Assay erstellen demonstriert. Bei Raumtemperatur entwickeln Xenopus Embryonen sehr schnell durch die Stufen 9 und 15. Indem sie bei 14 ° C, die Entwicklung des Embryos wird verlangsamt und viele weitere Transplantationen können in einem Experiment durchgeführt werden. Sollte es notwendig sein, um die Embryonen zu älteren Stadien (&gt; 42/43) wachsen w...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Viele Proteine ​​spielen eine doppelte Rolle in der embryonalen Entwicklung. Diejenigen, die Zelle Schicksal Bestimmung in einem bestimmten Gewebe zu regulieren kann auch Auswirkungen auf die Entwicklung einer größeren Region des Embryos. Dies macht die Definition seiner Rolle in einem bestimmten Gewebe schwer zu analysieren. Zum Beispiel,<em&gt; Noggin</em&gt; Überexpression in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen bewirkt, dass der Ausbau des gesamten vorderen Bereich, einschließlich der Augen<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Aus diesem Ergebnis ist es nicht bekannt, ob Noggin spielt eine direkte Rolle in Auge Bestimmung oder indem ein Ausbau des Nervengewebes, Noggin indirekt auf die Entstehung des Auges. Nachdem dieser komplexen Phänotyp macht das Studium ihrer Augen-spezifische Rolle in der Zelle Schicksal Bestimmung schwer zu analysieren. Wir haben einen Test, dass dieses Problem überwindet entwickelt. Unter Ausnutzung der pluripotenten Charakter der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tier Kappe<sup&gt; 3</sup&gt; Wir haben einen Test auf die Fähigkeit von Gen-Produkt (e)-Test entwickelt, wie<em&gt; Noggin</em&gt; Oder das Auge Feld Transkriptionsfaktoren (EFTFs), um Kappen in bestimmte Gewebe oder Zelltypen zu verwandeln durch die Transplantation von diesem Gewebe auf die Seite des Embryos<sup&gt; 4</sup&gt;. Während wir fanden entweder Noggin-Protein-Behandlung oder eine Sammlung von Transkriptionsfaktoren können retinale Zelle Schicksal in der Tier-Mützen zu bestimmen haben, kann das Verfahren verwendet werden, um Gen-Produkt (e) in der Angabe anderer Gewebe ebenfalls beteiligt zu identifizieren.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Tierische caps überexprimierenden Genprodukt (e) auf die Flanke der Entwicklung von transplantierten<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen, um festzustellen, ob Gewebe bestimmt wird.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K Aufrufe.  SUNY Upstate Medical University. Tierische caps überexprimierenden Genprodukt (e) auf die Flanke der Entwicklung von transplantierten Xenopus laevis Embryonen, um festzustellen, ob Gewebe bestimmt wird.

Serie: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Brustepithelzellen Transplantation

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...