Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel von der University of North Carolina in Charlotte, Wachovia Stiftungsfonds für Dozenten excellence, und einem Zuschuss von NIGMS (R15GM101571) vorgesehen ist.

Ein. LSE Vorbereitung <ol><li> Female Fröschen (Xenopus laevis) zweimal für Eiersammlung injiziert. Die erste Injektion (Grundierung) 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) pro Frosch. Frösche muss grundiert mindestens zwei Tage vor induzierende Eiablage und grundiert Frösche sind geeignet für bis zu zwei Wochen. Um prime Frösche, injizieren PMSG subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einem 3 ml-Spritze und 27 G Nadel. </li><li> Um Eiablage zu induzieren, zu injizieren 500 U hCG (humanes Chorion Gonadotropin) pro grundiert frog subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einer 27 G Nadel. Inkubieren injizierten Frösche in separaten Eimer mit 2 Liter 1x Marcs modifizierte Ringer-Lösung (MMR). Lassen Frösche 14-20 hr Eier vor der Abholung zu legen. </li><li> Entfernen Sie die Frösche aus den Eimern und gießen Sie das MMR-Lösung bis etwa 100 ml übrig ist. Erhalten Eier von den Schaufeln durch Übertragen Eier in einen 250 ml-Becher. </li><li> Dejelly Eier durch Zugabe von 100 ml 2% Cystein (EinstellungpH-Wert auf 7,8 mit 10 M KOH). Vorsichtig schwenken die Eier mit einem umgekehrten Glas Pasteur Pipette (0,7 cm Durchmesser) etwa alle 30 Sekunden. Dekantieren und ersetzen mit frischen Cystein zweimal während der Inkubation. Die dejellying abgeschlossen ist in etwa 5-15 Minuten, wenn die Eier einen kondensierten Schicht am Boden des Bechers zu bilden. </li><li> Entsorgen Sie die Cystein-Lösung und waschen Eier dreimal mit 0,25 x MMR. Swirl die Eier in der Lösung durch eine Glaspipette. &quot;Bad&quot; Eier werden durch einfache Sichtprüfung bestimmt und sind &quot;puffy&quot; weißes Aussehen. Die &quot;schlechten&quot; Eier in der Mitte des Bechers nach wirbelnden ansammeln. Entfernen Sie &quot;schlechte&quot; Eier von einer Pasteur-Pipette. </li><li> Waschen Sie Eier mit Ei Lysis Buffer (ELB) dreimal. Entfernen Sie alle zusätzlichen &quot;schlechte&quot; Eier von einer Pasteur-Pipette. Gießen Eier in eine 14 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie das Falcon-Röhrchen für 55 sec bei 188 xg (1.100 rpm) mit dem CL2 IEC klinischen Tischzentrifuge mit einem Ausschwingrotor, um die Eier zu verdichten. Entfernen Sie das überschüssige Puffer aus derSpitze des Ei-Schicht. Fügen Sie 0,5 ul Aprotinin / Leupeptin Lager und 0,5 ul Cytochalasin B Bestand pro ml des verdichteten Eier. </li><li> Zentrifuge Eier bei 16.500 × g (10.000 UpM) für 15 min bei 4 ° C unter Verwendung des Sorvall RC6 zuzüglich superspeed Zentrifuge mit HB6 Ausschwingrotor. Nach Zentrifugation fraktioniert sind Eier in drei Schichten in der Röhre: Lipid-Extrakt, und Dotter / Pigment von oben nach unten sind. Punktieren der Seite des Falcon-Röhrchen in dem unteren Abschnitt der mittleren Schicht mit einem Extrakt 21 G Nadel. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel die Punktionsnadel durch Kunststoff verbaut werden kann. Legen einen neuen 21 G Nadel, die an einer 1 ml-Spritze in die Punktionsstelle, um den Extrakt zu sammeln. Langsam absaugen Extrakt in die Spritze, um Luftblasen und Verunreinigungen mit der Lipid-und Eigelb / Pigment Schichten zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die Extrakte in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für jeden Milliliter Ei-Extrakt, fügen Sie die folgende chemische Stammlösungen der insyndizierte Endkonzentration (in Klammern): (1) 10 ul Cycloheximid (100 ug / ml); (2) 1 ul Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml); (3) 1 ul Cytochalasin B (5 pg / ml ); (4) 1 ul Dithiothreitol (1 mM) und (5) 0,33 ul Nocodazol (3 pg / ml). Invert das Ei zu extrahieren mindestens 10 mal sanft. Dies ist die LSE, die frisch zubereitet werden müssen und innerhalb von 4 Stunden. Die Qualität der LSE wird nach 4 h oder Frost-Tau beeinträchtigt. </li></ol> 2. Treatment of Sperm Chromatin mit DNA-schädigenden Approaches <ol><li> Planen normalen Spermienchromatinstruktur gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren 13. </li><li> Bereiten Sie MMS-behandelten Spermienchromatin <ol><li> Resuspendieren normalen Spermienchromatin in 0,5 ml Puffer X. </li><li> Fügen Sie ~ 5,5 ul von MMS (9,1 M in stock) zu 500 ul resuspendiert Chromatin zu einer Endkonzentration von 100 mM. </li><li> Inkubieren Spermienchromatinstruktur in Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für 30 min mit der Drehung. </li><li> Drehen Sie das microcentrifuge Rohr bei 686 xg (2.100 rpm) für 10 min bei Raumtemperatur mit dem IEC CL2 klinischen Zentrifuge mit Ausschwingrotor und Rohradapter. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml Puffer X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) und Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte (4) und (5) zweimal, um die Spermienchromatin waschen. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Spermien Chromatin mit einem Hämozytometer und verdünnt auf 100.000 Spermien / ul. Sparen mit 5 ul Aliquots in -80 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Bereiten UV-behandelten Spermienchromatin <ol><li> Hinzufügen gewünschter Betrag (z. B. 10 ul) von normalen Spermienchromatinstruktur auf der Oberfläche eines Stücks Parafilm. </li><li> Legen Sie die Parafilm in einem UV-Crosslinker. Stellen Sie die gewünschte Energie-Parameter, je nach Experiment, und beginnen, die Spermienchromatin via UV-Licht beschädigt werden. Beispielsweise dauert es etwa 21 Sekunden bis 1.000 J / m 2 zu erreichen. </li><li> Nach der UV-Bestrahlungsstrahlung, UV-behandelten Spermienchromatin sollten Ei Extrakte sofort gutgeschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung eines DNA-Damage-nachahmende Struktur (AT70) <ol><li> Aufzulösen zwei synthetische Oligonukleotide Poly-(dA) 70 (bezeichnet als A70) und Poly-(dT) 70 (bezeichnet als T70) in Wasser auf eine Konzentration von 2 ug / ul sind. </li><li> Fügen Sie 100 ul A70 und 100 ul T70 zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sieden gemischten synthetischen Oligo-Lösung für 5 min bei 95 ° C in einem heatblock. </li><li> Nehmen Sie die Trockenbad Block aus (mit dem Rohr mit AT Mischung davon), und lassen Sie es abkühlen auf Raumtemperatur auf einem Labortisch. Diese Temperatureinstellung dauert etwa 45-60 min. </li><li> Das abgekühlte Gemisch wird AT70 mit einer endgültigen Konzentration von 2 ug / ul. Shop 10 ul AT70 Aliquots bei -20 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung. </li></ol> 4. Das Auslösen der DNA Damage Checkpoint in LSE mit Damaged Sperm Chromatin oder DNA-Schäden-Ähnlichen Struktur <ol><li> DNA-Schädigung induziert Checkpoint in LSE mit beschädigten Spermienchromatin <ol><li> Fügen Sie 50 ul LSE zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und ergänzen Sie es mit 1 ul of Energy Mischung und 2 ul beschädigten Spermien Chromatin (Endkonzentration ~ 4.000 Spermien / ul Reaktion). </li><li> Inkubieren das Reaktionsrohr bei Raumtemperatur für 90 min und Flick das Rohr alle 10 min. </li><li> Dispense 1 ul Reaktionsgemisch auf einen Objektträger mit 1 ul der nuklearen Farbstofflösung nach 30-minütiger Inkubation ergänzt. Legen Sie ein Deckglas über dem Reaktionsgemisch und überprüfen Keimbildung über Fluoreszenz-Mikroskop. Typischerweise wird rundkernigen nach 30 min Inkubation bilden, der angibt, DNA-Replikation initiiert. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul des Reaktionsgemisches in 90 ul Probenpuffer. Die Proben werden mittels Immunoblot mit anti-Chk1 P-S344 oder Anti-Chk1 Antikörpern analysiert. </li></ol></li><li> DNA-Schädigung induziert Checkpoint in LSE mit derAT70 <ol><li> Fügen Sie 50 ul LSE zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ul of Energy Mischung und 1,6 ul Tautomycin Lager ergänzt. </li><li> Hinzufügen 1,25 ul von vorgefertigten AT70 (2 ug / ul) oder Wasser (als negative Kontrolle) zu jeder Reaktion. Inkubieren der Reaktionen bei Raumtemperatur für 90 min. Flick die Reaktionsrohre alle 10 min. </li><li> Fügen Sie 10 ul des Reaktionsgemisches in 90 ul Probenpuffer. Die Proben werden mittels Immunoblot mit anti-Chk1 P-S344 oder Anti-Chk1 Antikörper untersucht. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die beschädigten Spermien Chromatin oder DNA-Schäden-ähnlichen Struktur kann die ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in der Xenopus Ei-Extrakt auszulösen. 2A zeigt, dass MMS Chk1 Phosphorylierung an Ser344 (Chk1 P-S344), die ein Indikator für ist induziert ATR-Kinase-Aktivierung. 2B zeigt, dass AT70, als DNA-Schäden-ähnlichen structure, löst auch Chk1 Phosphorylierung. Insgesamt Chk1 Proben werden als Be-Kontrollen in beiden Beispielen verwendet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Diagramm der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Abbildung 2. Chk1 Phosphorylierung wird durch entweder MMS oder AT70 Behandlungen in Xenopus-Extrakten Ei induziert. (A) MMS-geschädigter Spermienchromatinstruktur (MMS) oder normale Spermienchromatinstruktur (Con) in Ei Extrakte werden für 90 min inkubiert. Chk1 Phosphorylierung an Ser344 (Chk1 P-S344) und insgesamt Chk1 in Ei-Extrakte werden über Immunoblot untersucht. (B) AT70 oder Wasser (Con) in Ei-Extrakten zugegeben. Proben werden auch über Immunoblotting, wie in (A) analysiert.

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es gibt mehrere Vorteile bei der Untersuchung der DNA-Schädigung unter Verwendung Prüfpunkt Xenopus Ei-Extrakten. Die Verwendung von Ei-Extrakten stellt eine große Menge von zellfreien Extrakten in Interphase des Zellzyklus synchronisiert. Die Ei-Extrakten kann leicht und kostengünstig hergestellt werden. Es ist relativ leicht zu DNA oder Chromatin beschädigen und einen Defekt in der DNA-Schädigung Checkpoint nach immunodepleting eines Zielproteins aus Eiextrakt offenbaren. Anschließend kann eine potenti...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 Antikörper </td><td> Cell Signaling </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Chk1 Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Methylmethansulfonat (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129.925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Probenpuffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Eimer für die Eiablage </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC Zentrifuge mit Ausschwingrotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 Ausschwingrotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 Plus Superspeed-Zentrifuge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH auf 7,8 mit 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / Leupeptin Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in Wasser. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M Sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH auf 7,5 mit HCl </td></tr><tr><td> Cycloheximid Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B Lager </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) stock </td><td></td><td></td><td> 1 M in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M Saccharose, 1 mM DTT, 50 ug / ml Cycloheximid, 2,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazol Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. Bewahren 5 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energie Mixture </td><td></td><td></td><td> 375 mM Creatinphosphat, 50 mM ATP und 25 mM MgCl 2. Aliquots werden bei -80 ° C gespeicherten </td></tr><tr><td> Nuclear Farbstofflösung </td><td></td><td></td><td> 0,4 ug / ml Hoechst 33258, 25% Glycerin(V / v), in 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin Lager </td><td></td><td></td><td> 100 uM in DMSO. Bewahren Sie 10 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Auf einer täglichen Basis, werden die Zellen zu einer Vielzahl von endogenen und Umwelteinflüssen ausgesetzt. Um diese Beleidigungen zu bekämpfen, haben Zellen DNA damage checkpoint Signalisierung als Überwachungs-Mechanismus, um DNA-Schäden und direkte zelluläre Antworten auf DNA-Schäden spüren entwickelt. Es gibt mehrere Gruppen von Proteinen namens Sensoren, Wandlern und Effektoren in DNA damage checkpoint-Signalisierung (Abbildung 1) beteiligt. In diesem komplexen Signalwegs ist ATR (ATM und Rad3-bezogen) einer der wichtigsten Kinasen, die zu DNA-Schädigungen und Replikation Streß reagieren. Activated ATR kann phosphorylieren seine nachgelagerten Substrate wie Chk1 (Checkpoint Kinase 1). Folglich phosphoryliert und aktiviert Chk1 führt zu viele stromabwärts Wirkungen in der DNA-Schädigung Prüfpunkt einschließlich Zellzyklusarrest, Transkriptionsaktivierung, DNA-Schäden zu reparieren und Apoptose oder Seneszenz (Abbildung 1). Wenn DNA beschädigt ist, es nicht die DNA damage checkpoint Ergebnisse in UNREP aktivierenausgestrahlt Schäden und anschließend genomische Instabilität. Die Untersuchung der DNA damage checkpoint wird klären, wie Zellen genomischen Integrität zu erhalten und ein besseres Verständnis davon, wie Krankheiten, wie Krebs, zu entwickeln. Xenopus laevis Ei Extrakte werden als starke zellfreien Extrakt Modellsystem in DNA-Schädigung Prüfpunkt Forschung entstehen. Low-Speed-Extrakt (LSE) wurde ursprünglich von der Masui Gruppe 1 beschrieben. Die Zugabe von demembranated Spermienchromatin LSE Ergebnisse in Keimbildung, wo DNA in einem semikonservativen fashion einmal pro Zellzyklus repliziert wird. Die ATR/Chk1-mediated Checkpoint-Signalweg ist durch DNA-Schädigung oder Replikation Stress 2 ausgelöst. Zwei Methoden werden derzeit verwendet, um die DNA damage checkpoint induzieren: DNA-schädigende Ansätze und DNA-Schäden-ähnlichen Strukturen 3. DNA-Schädigung durch Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, γ-Bestrahlung, induziert werden Methyl methanesulfonate (MMS), Mitomycin C (MMC), 4-nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) oder Aphidicolin 3, 4. MMS ist ein Alkylierungsmittel, das DNA-Replikation hemmt und aktiviert der DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt 4-7. UV-Bestrahlung löst auch die ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. Die DNA-Schädigung nachahmende Struktur AT70 ist ein Komplex aus zwei getemperten Oligonukleotide Poly-(dA) 70 und Poly-(dT) 70. Die AT70 System wurde Bill Dunphy Labor entwickelt und wird häufig verwendet, um ATR/Chk1 Checkpoint Signalisierung 9-12 induzieren. Hier beschreiben wir Protokollen (1) bis zellfreie Extrakte Ei (LSE) herzustellen, (2) an Xenopus Spermienchromatinstruktur mit zwei verschiedenen DNA schädigen Ansätze (MMS und UV), (3) zu behandeln, um die DNA-Schäden-nachahmende Struktur vorzubereiten AT70, und (4) die DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt in LSE mit beschädigten Spermienchromatinstruktur oder einem DNA-Schaden-nachahmende Struktur auslösen.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K Aufrufe.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.

Serie: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Forschung

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.

Demonstration des DNA-Faser-Assays zur Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturdynamik durch Nanopartikel

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Proteininteraktion und -lokalisation bei DNA-Schäden

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kombination von Proximity-Liganden-Assay mit Gamma-H2AX-Färbung zur Charakterisierung von Proteininteraktionen in der DNA-Schadensantwort

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...