Wir danken Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond und alle ehemaligen und derzeitigen Mitglieder der Berger Labor für Hilfe und Beratung. Die MultiBac Plattform und deren Entwicklung wurden und werden großzügig durch die Finanzierung von Stellen, einschließlich des Schweizerischen Nationalfonds (SNF), der Agence Nationale de Recherche (ANR) und dem Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) und der Europäischen Kommission (EC) unterstützt in Rahmenprogramme (FP) 6 und 7. Unterstützung für den grenzüberschreitenden Zugang wird durch die EG-RP7-Projekte P-CUBE (vorausgesetzt <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) und BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). Die Französisch Ministerium für Wissenschaft ist besonders für die Unterstützung der MultiBac Plattform am EMBL durch die Investissement d&#39;Avenir Projekt FRISBI anerkannt.

1. Tandem Recombineering (TR) für das Erstellen Multigen Expression Konstrukte <ol><li> Planung der Co-Expression Strategie. Design-Ansatz für die Aufnahme Ihrer Gene von Interesse in Donatoren und Akzeptoren. Mögliche physiologische Submodule Ihrer komplexen sollten zusammen auf spezifische Akzeptoren und Donatoren gruppiert werden. Verwenden Multiplikation Modul bestehend aus Homing Endonuklease (HE) - BstXI Paare Expressionskassetten auf einzelne Donor und Akzeptor Plasmide kombinieren 7,8 Erstellen Sie alle relevanten Konstrukte in silico und Validierung Strategie gründlich, bevor Sie mit experimentellen Arbeiten.. Zum Beispiel sollte die Gene von Interesse ausgewählt nicht zu enthalten HE oder andere Restriktionsstellen und die Anwesenheit der korrekten offenen Leserahmen (ORFs) validiert werden soll. Überlegen Sie daher synthetische Gene für Insekt Zelle Codonverwendung und mRNA sekundäre Struktur optimiert, um Protein-Produktion Ebenen sowie Beseitigung jeglicher exi verbessernstechen HE Websites aus den Genen von Interesse. Erwägen Sie, Reinigungs-Tags basierend auf Daten aus der Literatur über flexible oder ausgesetzt N-oder C-Termini von Proteinen Ihrer Wahl. Betrachten Sie die Anwendung polyprotein Strategien, die auf die Herstellung mehrere Protein-Untereinheiten in Ihrer komplexen zielen, wenn die relativen Mengen der einzelnen Proteine ​​aufgrund Stöchiometrie Fragen im Komplex kontrolliert werden müssen. 4 Ausarbeitung detaillierter &quot;How-To&quot;-Dokument (electronic book Labor wird empfohlen) mit Alle projiziert experimentellen Schritte des Projekts im Vorfeld der vollständigen multigene Konstrukt (n). Erstellen Sie elektronische Dateien der Cre-LoxP fusionierten Plasmide zum Beispiel mit Hilfe des Cre-ACEMBLER Software, die von der Berger Gruppe Homepage (heruntergeladen werden kann <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler</a> ). </li><li> Legen Sie Ihre Gene von Interesse in ausgewählte Spender undAkzeptoren durch Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase, oder alternativ durch Ligation unabhängigen Methoden nach veröffentlichten Protokollen. 5,6,14 Wenn Sie Zugang zu einem Liquid-Handling-Arbeitsplatz und wenn Sie planen, eine große Anzahl von Konstrukten erzeugt werden ( zum Beispiel für die kombinatorische Ansätze) erwägen Robotik Script entwickelt und von der Berger-Gruppe (Abbildung 2). 14,15 implementiert Wenn ein Liquid-Handling-Arbeitsplatz nicht zur Verfügung steht, ermöglicht die manuelle Bedienung über Mikrotiterplatten Geninsertion in einem HT wie Mode. </li><li> Einschränkungen durch die Notwendigkeit, die Stöchiometrie der Untereinheiten steuern ausgedrückt auferlegt materialisieren. Im Falle der stöchiometrisch unausgewogenen Expression von einzelnen Untereinheiten eines Proteinkomplexes, in Erwägung ziehen, Polyprotein Strategien auf mehrere Untereinheiten des Komplexes und eine spezifische Protease (z. B. Tabakätzvirus NIa Protease) in einzelnen großen ORFs von s beabstandet conjoinpecific proteolytische Websites. 4,8 Betrachten Zusammenarbeit, die ein oder mehrere Polyproteine ​​mit einzelnen Expressionskassetten wenn Sie eine sehr große Anlage mit vielen Untereinheiten und haben weit reichen Molekulargewichte der einzelnen Untereinheiten. Betrachten Koexpression mehrerer Gene, die für das gleiche Protein in ein Polyprotein oder mehrere gleiche Expressionskassetten wenn das Protein durch eine niedrige Produktion Ausbeute auszeichnet. 4,13 </li><li> Bestätigen Sie alle Donor und Akzeptor Konstrukte durch Restriktionskartierung (wahlweise in High-Throughput) und Sequenzierung geklont. Fahren Sie mit Donor-Acceptor-Kombinationen durch Cre-Rekombination LoxP verschmelzen, um die multigene Ausdruck Konstrukte der Wahl zu erzeugen. Bestätigen gereinigt Acceptor-Donor Fusion Plasmide durch Restriktionskartierung, verwenden elektronische Sequenzen durch Cre-ACEMBLER oder ähnlichen Programmen als Referenz erstellt. </li><li> Bewahren gereinigt und validiert Spender, Akzeptoren und Donor-Acceptor Fusionen bei -20 ° C oder -80 ° C. Archiv plasmids und ihre Sequenzen (Microsoft Excel, Filemaker, etc.) sorgfältig zur späteren Verwendung. </li></ol> 2. Composite-Multigen Baculovirus Erzeugung, Verstärkung und Lagerung <ol><li> Integrieren multigene Transfervektoren die MultiBac baculovirale Genom durch Umwandlung in DH10-Zellen, die das virale Genom und die Funktionalitäten für Tn7 Umsetzung erforderlich. Beachten Sie, dass die MultiBac Baculovirus-Genom mit bestimmten Genen von Interesse (YFP Marker, Chaperone, etc.) in einem eigenen loxP-Stelle (entwickelt in das Genom distal zum Tn7 Bindungsstelle) durch eine in vivo Cre Reaktion vorhergehenden Tn7 Integration vorgespannt werden. 13 Nach Tn7 Umsetzung werden die Zellen mit Composite Baculovirus enthält die Gene von Interesse durch blau / weiß-Screening (erfolgreiche Tn7 Umsetzung führt zu einem Verlust von α-Komplementierung der β-Galactosidase, daher bleiben Kolonien mit richtigen Tn7 Umsetzung auf selektiven einem weißengar Platten mit X-gal) und das Genom wird durch alkalische Lyse und Ethanol / Isopropanol-Fällung hergestellt. 5,6 </li><li> Transfektion und erste Virus-Produktion. Platz 6-Well-Gewebekulturplatten in sterile Haube. Von log-Phase Sf21 Insekt Zellkultur, Samen aus Aliquots von Zellen in den Vertiefungen und Transfektion durch Zugabe des gereinigten baculovirale Genom und eine Transfektionsreagenz in Kulturmedien gemischt, wie beschrieben. 6 Ernte anfänglichen Virus nach 48-60 Stunden durch Entfernen der Medien ( hohe Qualität, niedrige Titer Virus V 0, in der Regel 3 ml pro Vertiefung). Beilage frisches Medium und Test für die Proteinproduktion (und, falls ein YFP Marker vorhanden ist, für die Fluoreszenz) nach weiteren 2-3 Tagen. 6,7 </li><li> Amplifikation von Virus, niedrige MOI Regime. Verwenden V 0 Virus auf 25-50 ml der Zellen in der log-Phase (Zelldichte &lt;1x10 6 Zellen pro ml) in kleinen (100-250 ml) Erlenmeyer Schüttelkolben aufgeregt infizierenauf orbitale Plattform Schüttler (Abbildung 3). Zählen von Zellen aufgeteilt und alle 24 Stunden, bis die Zellen aufhören Verdoppelung (Proliferation Verhaftung). Folgen einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion dh Anzahl von Viruspartikeln pro Zelle) Therapie: Die Zellen müssen verdoppeln (mindestens) einmal (MOI &lt;1), ansonsten Wiederholen Experiment mit einem kleineren Volumen V 0 zugegeben. Üblicherweise werden 3 ml V 0 verwendet, um 25 ml der Sf21 Insektenzellen mit einer Dichte von 0.5x10 6 Zellen / ml infiziert. Dies ist wichtig, um zu verhindern, nachteilig Überverstärkung und automatische Löschen von Viren, die zu einem Verlust der heterologen Genen von Interesse führen. Ernte-V 1-Virus (25-50 ml) nach 48-60 Stunden durch Pelletierung Zellen und Entfernen der Medien, die das Virus. Ergänzung mit frischen Medien und Test für YFP und Proteinproduktion durch Entfernen 1x10 6 Zellen alle 12 oder 24 Stunden, Pelletierung und Validierung von Protein-Produktion und Marker-Protein (YFP)-Signal. 6, Amplify Virus (zuV 2) weiter, wenn größere Mengen an Expression durch Infektion bis zu 400 ml Zellen in 2 L Schüttelkolben mit V 1-Virus unter Beachtung der oben genannten niedrigen MOI Regime (Zellen muss mindestens einmal verdoppeln nach Infektion mit V 1) ab. Stringent testen Proteinproduktion und Markerprotein Signal während der Amplifikation zu einer Akkumulation von defekten Viren nicht mehr mit den Genen von Interesse zu vermeiden. 5-7 Use Zellpellets akkumulieren bei jedem Schritt bereits Verstärkungen für die Festlegung Aufreinigungsprotokolle für den Ausdruck Protein-Komplex von Interesse. </li><li> BIIC Lagerung von Produktion Virus. Wir empfehlen dringend, V 2-Virus, wie die Produktion Virus zu speichern, indem Sie die BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c Ellen)-Methode, um Änderungen (z. B. Verlust des Gens von Interesse) des rekombinanten Virus zu verhindern und hohe Expression bewahren Ebenes 16 Pellet infizierten Zellen 24 Stunden nach der Festnahme Proliferation beobachtet wird -. in diesem Stadium Zellen enthalten komplette Viruspartikel kurz bevor sie freigegeben (durch Knospung) in den Medien werden. Entfernen Medien und gefriergetrocknet Aliquots des Zellpellets in flüssigem Stickstoff und speichern unbegrenzt. 7,16 </li></ol> 3. Protein Produktion und Downstream Processing <ol><li> Infizieren große (r) Kulturen und Überwachung YFP. Verwenden V 1, V 2 oder gefroren BIIC Aliquots zu größeren Zellkulturen für die Produktion läuft (in der Regel 400 ml in 2 L Flaschen) zu infizieren. Halten Sie sich an niedrigen MOI Regime (Virus anpassen Volumen für die Infektion verwendet werden, so dass infizierte Kultur verdoppelt mindestens einmal). Vergrößern infizierten Kultur Bände, wenn durch die Anzahl der Flaschen benötigt. Wenn YFP Markerprotein vorhanden ist, in definierten Abständen 1x10 6 Zellen zurückziehen, Pellet-und lysieren Zellen und überwachen Entwicklung des YFP-Signal, bis ein Plateau erreicht ist indicating maximale Produktion rekombinanter Proteine. YFP Ebenen können in einem Standard-96-Well-Platte Leser fähig zur Aufnahme Fluoreszenz-Signale (zB Tecan SPECTRAFluor) gemessen werden. Ernten Sie die Zellen in diesem Stadium. Shop Zellpellets bei -20 ° C (kurzfristig) oder -80 ° C (langfristig). </li><li> Zelllyse und Fraktionierung. Lyse Zellen von Ihrem Lieblings-Methode der Wahl, zugeschnitten auf die Anforderungen Ihrer Protein (Frost-Tau-, Beschallung, Französisch Presse, ua). 5-7 Fraktionierung Cytosol und Zellkerne und Test für die Präsenz Ihrer Proteine ​​von Interesse. Entwickeln Aufreinigungsprotokolle basierend auf den Ergebnissen zur Proteinreinigung zu vereinfachen. Betrachten Sie die Anwendung Einweichen Verfahren, um Ihre Protein aus dem Kernfraktion extrahieren unter hohem KCl Bedingungen, wenn Ihr Proteine ​​im Zellkern befinden. 7,18 </li><li> Proteinreinigung (Mikro-Skala, in großem Maßstab). Beachten Sie, dass oft kleine Mengen (10 oder 25 ml) von Zellkultur-su sindizient für den Erhalt von Zell-Pellets zur Reinigung erhebliche Mengen an Ihre Proteine ​​von Interesse aufgrund der typischerweise hohen oder sehr hohen Produktionsniveau von heterologen Proteinen in den Baculovirus / Insektenzellen-Systeme (oft 10-100 mg Protein pro L Kultur und mehr). In Verbindung mit Mikro-Reinigung (Multiwellplatten, microtip Methoden, GE Healthcare ÄKTAmicro System, etc.) ist es möglich, biochemischen und Aktivität Daten und oft auch ausreichende Menge der gewünschten Proteine ​​und Komplexe für nanoliter Maßstab Hochdurchsatz-Kristallisation (HTX erhalten ). Betrachten unter Verwendung von Metall Affinitätsreinigung (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metallchelator Harze) und einen Oligo-Histidin (6-10 Reste) tag auf freiliegenden Untereinheiten des Proteinkomplexes, um die Reinigung zu erleichtern, in Verbindung mit Ionenaustausch-und Größenausschluss-Chromatographie in kleinen Volumes mit zum Beispiel den ÄKTAmicro oder ein ähnliches kleines Volumen Reinigung Maschine (Abbildung 4 </stRong&gt;). Andere Affinität Reinigungsschritte und Ionenaustausch (IEX) Schritte neben der Affinitätsreinigung mit Oligo-Histidin-Tags oder anderen Tags (von GST, MBP, CBP, andere wählen) können und sollten in Betracht gezogen werden, je nach den biochemischen Eigenschaften der Proteine von Interesse und individuellen Vorlieben. Betrachten Tagging mehr als eine Untereinheit mit Affinität Tags zu Reinigungsleistung zu verbessern. Konzentrieren Sie Ihre gereinigtes Protein-Komplexe und etablieren Storage-Protokolle wie das Einfrieren mit oder ohne Glycerin. Entwickeln Qualitätskontrolle Kriterien, die üblicherweise angewendet werden können (Aktivitäts-Assays, biochemischen und biophysikalischen Tests) zu Charge zu Charge Variation des gereinigten Proteinen zu beurteilen. </li></ol>

<ol>
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O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. 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D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB ist Erfinder von Patenten und Patentanmeldungen Detaillierung Teile der Technologie hier beschrieben.

Video Snap-shots in den Abbildungen 2 und 3 zeigen den gesamten Prozess von Roboter-assistierte Generation von cDNA multigene Ausdruck baut den ganzen Weg nach Infektion von Insekten Zellkulturen für die Proteinproduktion. New Reagenzien (Plasmide und Viren) und robuste Protokolle wurden entwickelt, um eine Pipeline sich auf SOP ermöglichen. Die gesamte Pipeline wurde als Plattform-Technologie am EMBL in Grenoble umgesetzt. Die MultiBac Plattform wurde von vielen Wissenschaftlern aus ...

Biologische Aktivität von Anordnungen von Proteinen und anderen Biomolekülen, die gemeinsam wirken, um zelluläre Funktionen katalysieren gesteuert. Bemerkenswerte Beispiele sind die Maschinen, die die Erbinformation in der DNA in Boten-RNA enthalten transkribiert. Beim Menschen kommen mehr als 100 Proteine ​​zusammen in einer definierten und geregelt Verfahren, um Gene zu transkribieren, wobei große Multiproteinkomplexen mit 10 und mehr Untereinheiten, einschließlich RNA-Polymerase II und der allgemeinen Transkriptionsfaktoren wie TFIID, TFIIH und andere. 9 Andere Beispiele sind die Ribosomen, die aus vielen Proteinen und RNA-Molekülen, die Proteinsynthese, oder die Kernporenkomplex die für pendelt Biomolekülen durch die Kernhülle in Eukaryoten katalysiert. Eine detaillierte Architektur und biochemische Präparation von im wesentlichen Mehrkomponenten-Maschinen in der Zelle ist wichtig, um ihre Funktion zu verstehen. Die Strukturaufklärung von prokaryotischen und eukaryotic Ribosomen, zum Beispiel, bildeten Markenzeichen Ereignisse eine beispiellose Einblicke in die Funktionsweise dieser makromolekularen Maschinen führen ihre vorgesehenen Funktionen in der Zelle. 10,11 Ribosomen in ausreichender Quantität und Qualität für detaillierte Studie durch Reinigen des endogenen Material aus kultivierten Zellen, aufgrund der Tatsache, dass bis zu 30% der Zellmasse von Ribosomen besteht, erhalten werden. RNA-Polymerase II ist bereits weniger reichlich um Größenordnungen, und viele tausend Liter Hefekultur mussten verarbeitet werden, um eine detaillierte atomare Angesichts dieser wesentlichen komplexe zentrale, um die Transkription zu erhalten. 12. Die überwiegende Mehrheit der anderen wesentlichen Komplexe sind jedoch in viel niedrigere Mengen in nativen Zellen und somit nicht ausreichend aus nativen Ausgangsmaterial gereinigt werden. Um solche Komplexe zugänglich detaillierte strukturelle und funktionelle Analyse machen erfordert heterologe Produktion durch Verwendung von rekombinanten techniques. Produktion rekombinanter Proteine ​​hatte einen großen Einfluss auf die Life-Science-Forschung. Viele Proteine ​​wurden rekombinant hergestellt und deren Struktur und Funktion bei hoher Auflösung seziert. Strukturelle Genomik-Programme haben den Vorteil der Aufklärung der Genome vieler Organismen, um das Genprodukt Repertoire von ganzen Organismen in High-Throughput (HT)-Modus anzugehen. Tausende von Protein-Strukturen sind damit bestimmt. Bis heute hat die produktiv genutzten System für Produktion rekombinanter Proteine ​​wurden E. coli, und viele Expressionssysteme entwickelt worden und im Laufe der Jahre verfeinert für die heterologe Produktion in diesem Wirt. Die Plasmide eine Fülle von Funktionalitäten zur Protein-Produktion in E. aktivieren coli füllen ganze Kataloge von kommerziellen Anbietern. Allerdings E. coli sind bestimmte Grenzen gesetzt, die es ungeeignet für viele eukaryotische Proteine ​​machen und in pGelenk-Protein-Komplexe mit vielen Untereinheiten. Daher wurde die Proteinproduktion in eukaryotischen Wirten immer die Methode der Wahl in den letzten Jahren geworden. Ein besonders geeignetes System eukaryontische Proteine ​​ist das Baculovirus-(BEVS), die auf einem rekombinanten Baculovirus Durchführung der heterologen Gene für Insekten Zellkulturen im Labor gezüchtet infizieren beruht. Die MultiBac System ist ein in jüngerer Zeit entwickelt BEVS die besonders für die Herstellung von eukaryotischen Protein-Komplexen mit vielen Untereinheiten (Abbildung 1) zugeschnitten ist. MultiBac erste wurde im Jahr 2004 eingeführt. 13 Seit seiner Einführung hat MultiBac kontinuierlich verfeinert und gestrafft, um die Handhabung zu vereinfachen, verbessern Zielprotein Qualität und in der Regel machen das System für Nicht-Fachanwender durch die Gestaltung effizienter Standard Operating Procedures (SOPs). 4 MultiBac hat in vielen Laboratorien weltweit umgesetzt, in acAdemia und Industrie. Am EMBL in Grenoble, wurden grenzüberschreitenden Zugang Programme anstelle von der Europäischen Kommission bis zum Experten Ausbildung an der MultiBac Plattform für Wissenschaftler, die dieses Produktionssystem für die Förderung ihrer Forschung nutzen wollten setzen. Der Aufbau und die Funktion von vielen Protein-Komplexe, die bisher nicht zugänglich waren, indem Proben mit MultiBac produziert wurde aufgeklärt. 4 Im Folgenden werden die wesentlichen Schritte der Produktion MultiBac in Protokollen zusammengefasst, wie sie im Betrieb auf der Anlage am MultiBac EMBL Grenoble sind.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Proteomics Forschung enthüllt die beeindruckende Komplexität von eukaryotischen Proteom in bisher unerreichter Genauigkeit. Es ist nun eine allgemein akzeptierte Vorstellung, dass Proteine ​​in Zellen existieren meist nicht als isolierte Einheiten, sondern üben ihre biologische Aktivität in Verbindung mit vielen anderen Proteinen beim Menschen zehn oder mehr bilden Montagelinien in der Zelle für die meisten, wenn nicht alle lebenswichtigen Funktionen. 1 , 2 Kenntnisse über die Funktion und die Architektur dieser Multiprotein Baugruppen erfordert ihre Bestimmung in höchster Qualität und ausreichender Menge für eine detaillierte Analyse. Der Mangel vieler Proteinkomplexe in Zellen, insbesondere in Eukaryonten, verbietet ihre Extraktion aus nativen Quellen und erfordert rekombinante Herstellung. Die Baculovirusexpressionsvektor System (BEVS) hat sich als besonders nützlich für die Herstellung von eukaryotischen Proteinen, deren Aktivität oft auf posttranslationale Prozessierung, dass andere häufig verwendete Ausdruck Systeme oft kannnicht unterstützt. 3 BEVS mit einem rekombinanten Baculovirus, in die das Gen von Interesse eingeführt wird, um Insekten Zellkulturen, die wiederum das Protein der Wahl infizieren wurde. MultiBac eine BEVS, die besonders wurde für die Herstellung von eukaryontischen Protein-Komplexe, die viele Untereinheiten enthalten zugeschnitten. 4 Eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung von Proteinen und deren Komplexe sind stabil Protokolle für alle Schritte in einem Ausdruck Experiment, das sich hervorragend als implementiert werden beteiligt Standard Operating Procedures (SOPs) und auch von Nicht-Spezialisten Nutzer vergleichsweise einfach gefolgt. Die MultiBac Plattform am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) verwendet SOPs für alle Schritte in einer Multiproteinkomplex Ausdruck Experiment beteiligt, ab Einsetzen der Gene in einer konstruierten baculovirale Genom für die heterologe Proteinproduktion Immobilien zum kleinen Analyse des Proteins optimiert Exemplare produziert. 5-8 Die Plattformwird in einer Open-Access-Modus bei EMBL Grenoble installiert und unterstützt viele Wissenschaftler aus Hochschule und Industrie, um Protein-Komplex Forschungsprojekte beschleunigen.

Starke Co-Expression von heterologen Proteinen durch die MultiBac System erreicht wird in 1d (Sonden gemacht 48 h nach Infektion eines Suspensionszellkultur) gezeigt. Die überexprimiert Proteinbanden eindeutig im Ganzzellextrakt (SNP) und dem geklärten Lysat (SN) erkennbar. Die Qualität und Quantität des Proteins hergestellt ist oft ausreichend, um Strukturaufklärung von Protein-Komplexen, wie der mitotischen Checkpoint komplexen MCC in 1e gezeigt aktivieren. 17 <p c...

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The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.8K Aufrufe.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Serie: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Gross Dissection der Magen der Lobster, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...