NIH Grant R01EY016099 und Forschung zur Erblindung Career Development Award Prevent: Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) und die folgenden Mittel zur XW unterstützt. Wir bedanken uns bei Kira Lathrop um Hilfe bei der konfokalen Bildgebung.

Tag 1. Vorbereitung 1. Set up Fisch Kreuze Set up paarweise Kreuze Zebrafisch in den Abend. Um zu verhindern, zufällige Paarung vor der gewünschten Zeit nutzen, um so zu den weiblichen und männlichen Fischen in der Paarung Kassetten zu trennen. GFP-exprimierenden transgenen Fische sind als eine Quelle der Spender Blastomeren verwendet. Die pt104 transgene Linie (Zou et al., 2008), hier verwendet wird, drückt GFP ubiquitär unter der Kontrolle des EF1-Promotor. GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von Spenderzellen mit Live-Bildgebung. Andere transgene Fische Linien, die geeignete fluoreszierende Proteine ​​exprimieren können für spezielle Bedürfnisse verwendet werden. 2. Bereiten keilförmige Agarose Brunnen für die Aufbewahrung des Embryos Gießen geschmolzen 1% Agarose in E3 Ei Wasser (Westerfield, 2007) vorbereitet, in eine Petrischale. Float eine plastische Form, die keilförmigen Vorsprünge auf dem Agarose-Lösung und lassen Sie die Agarose-Lösung vollständig erstarren. Entfernen Sie den Schimmel vorsichtig und tauchen die Agarose Bett mit E3 Wasser. 3. Bereiten Transplantation Nadeln Verwenden Sie eine vertikale Needle Puller (David Kopf Instruments) bei Leistungsstufe 11,5 auf Nadeln, indem Glaskapillare Pipetten (World Precision Instruments) zu machen. Gute Nadelspitzen sollte Kegel mit langen Wellen. Grind die Nadelspitzen in einem 45-Grad-Winkel mit einer Micro Grinder (Marishige) bis abgeschrägten Öffnungen der 40-45μm Innendurchmesser erhalten (Abb. 1A). So bereinigen Sie die Nadelspitzen, legen einen Schlauch an das stumpfe Ende der Nadel, verbinden Sie den Schlauch mit einer Spritze, und dann saugen und lassen Sie eine 10% ige Flusssäure-Lösung, bis alle sichtbaren Verschmutzungen entfernt. Anschließend waschen Sie sie mit destilliertem Wasser, um 100% Ethanol gefolgt. Der Luft trocknen die Nadeln, bis alle Ethanol verdunstet. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spitzen trocken sind: Restethanol werden die Nadeln während der Hochtemperatur-Polierschritt ruinieren. Zu erweichen und zu polieren die Ecken und Kanten der Nadelspitzen, backen die Nadelspitzen mit der Wärme, die durch das Filament eines Micro Forger (Marishige) generiert. Lassen Sie sich nicht die Nadelspitzen berühren den Faden beim Polieren. Die Menge an Strom vorbei wenn der Faden und der Abstand zwischen dem Filament und die Nadelspitzen können angepasst werden, um gewünschte Erwärmung Bedingungen zu erreichen sein. Die Temperatur sollte nicht zu hoch sein: Dies wird schmelzen und verformen die Nadelspitzen. Nach der Ecken und Kanten geglättet sind, sorgfältig berühren Glühfaden mit der Nadelspitze und ziehen Sie dann vorsichtig den Faden von der Nadel zu einem spitzen Ende (Abb. 1B) zu generieren. Eine scharfe, glatte und saubere Nadel ist entscheidend für den Erhalt intakter Spender Blastomeren und nicht zu beschädigen den Host-Embryonen. 4. Bereiten Sie ein Embryo-Positionierung Sonde Ziehen Sie eine Glaspipette über einer Gasflamme, um ein gutes Glas-Sonde mit einer geglätteten Ende erhalten. Diese Sonde wird verwendet, um die Embryonen in der richtigen Orientierung vor der Transplantation zu positionieren. Tag 2. Blastomere Transplantation 1. Sammeln und dechorionate Embryonen Am nächsten Tag, entfernen Sie die Trennwände in der cross-Kassetten für Fische zu paaren können. Legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 Wasser gefüllt. Dann dechorionate Embryonen, die durch manuelle Abreißen der Chorion aus den Embryonen mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie eine Glaspipette mit gebogenem Schaft sorgfältig übertragen dechorionated Embryonen in Agarose Brunnen. Vermeiden Sie jeden Kontakt des Embryos mit der Luft, Ursache, welche die Embryonen zu platzen. Lassen Sie die Embryonen bei 28,5 ° C zu entwickeln in der Agarose Brunnen bis 3 Stunden nach der Befruchtung, oder hpf. 2. Einrichten einer Transplantation Apparat Während die Embryonen entwickeln, die Einrichtung eines Transplantation Gerät durch den Anschluss der Transplantation Nadel auf die Mineralöl gefüllten Mikro-Pumpen-System. Stellen Sie sicher, dass das System nicht auslaufen und keine Luftblasen im System gefangen. Zurück füllen den gesamten Transplantation Nadel mit Mineralöl, mit Ausnahme der 0,5 bis 1 pl Platz an der Spitze öffnen. 3. Die Transplantation von Blastomeren Um Transplantation Blastomeren, verwenden Sie ein Glas Positionierung Sonde in die Blastomeren Seite des 3-4-hpf Embryonen nach oben zu orientieren. Dann schieben Sie die Nadel in die Transplantation eines Spenders Embryo und langsam aufsaugen 5-20 Blastomeren in die Nadel. Legen Sie die Blastomeren gefüllte Nadel in eine Host-Embryo und lassen Sie die Blastomeren langsam. Der Ort, an dem die Blastomeren freigesetzt werden, beeinflussen, wo ihre Nachkommen in späteren Entwicklungsstadien zu lokalisieren. Um Netzhaut und der Entwicklung des Gehirns, Release-Zellen am animalen Pole zu analysieren. Während der Transplantation, stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze nicht in Kontakt mit Luft. Zur Minimierung von mechanischen Schäden tragen die Aufnahmestaaten Embryonen in die Agarose Brunnen bei 28,5 ° C bis zum nächsten Tag verlassen. Dann, transfer das Mosaik Embryonen bis 24-Well-Platten vorbeschichtet mit 0,5 ml 1% Agarose mit einem Embryo in jede Vertiefung. 1 ml der E3 Ei Wasser in jede Vertiefung gegeben. Um zu verhindern, bakterielle Infektionen, fügen Sie 10 ul 100X Penicillin und Streptomycin auf die E3 Ei Wasser. Tag 3. Embedding und Live-Darstellung von Mosaik Embryonen 1. Embedding Embryonen Bereiten Sie 1,5% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (LMP) in E3 Ei Wasser und halten Sie die Lösung in einem 30 ° C Wasserbad. Transfer-Mosaik Embryo zu einem FluoroDish Gewebe Kulturschale mit einem Glasboden der 0,17 mm in der Dicke (World Precision Instruments). Entfernen Sie überschüssiges Wasser E3 auf den Embryo nur durch eine minimale Menge an E3 bedeckt verlassen. Add 30-50 ul geschmolzen 1,5% LMP auf den Embryo. Schnell Position des Auges oder des Gehirns zu den Glasboden nah wie möglich vor dem Agarose-Lösung erstarrt. Nachdem die Lösung abgekühlt ist, fügen Sie zusätzliche Agarose-Lösung zur weiteren Sicherung der Embryonen statt. Dann tauchen die erstarrte Agarose-Block mit 2-3 ml E3 Ei Wasser. 2. Konfokale Bildgebung Für die konfokale Mikroskopie, ist eine Wasser-Immersions-invertierten Ziel (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japan) mit großer Tiefenschärfe verwendet. Ein Tropfen Wasser auf die objektive hinzugefügt und dann einen FluoroDish Gewebekulturschale auf das Ziel. Um Bild-Entwicklung, Durchführung Zeitraffer-Bildgebung durch Fotografieren der Embryonen alle 5 Minuten. Je nach Art von Experimenten sollte die Zeitintervalle zwischen den Aufnahmen eingestellt werden. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt eine repräsentative 24-hpf Mosaik Zebrafisch. GFP-Expression Highlights der Spenderzellen in grün. Die Netzhaut Neuroepithelzellen deckt dabei die gesamte Dicke der Netzhaut Wand. Der Film zeigt die Bewegungen der Spenderzellen in den Host Gehirn bei 24 hpf. Unsere Zellen Morphologien Laufe der Zeit ändern. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Shapes der Transplantation Nadelspitzen. A. Die abgeschrägte Öffnung der Spitze einer Nadel war frei von Schmutz nach Flusssäure wäscht. B. Ein spitzes Ende war an der Nadelspitze erzeugt. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Visualisierung von GFP-exprimierenden Spenderzellen in einem chimären Zebrafischembryonen bei 24 hpf. Die linke Tafel zeigt die GFP-Signale im Gehirn und Netzhaut. Das mittlere Feld ist ein helles Feld Bild des Embryos. Das rechte Bild zeigt das zusammengefügte Bild. Movie 1. Live Darstellung von GFP positive Spenderzellen zeigten die umfangreichen Änderungen in der Morphologie des Gehirns Neuroepithelzellen während der Entwicklung. Die Einzelbilder des Films wurden alle 5 Minuten zwischen 24 und 25 hpf gesammelt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Klicken Sie hier um den Film zu sehen</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Blastomere Transplantation der Retina und die Entwicklung des Gehirns beim Zebrafisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Geweben und Organen durch einfaches Loslassen der Spender Blastomeren zu entsprechenden Stellen in den Host-Embryonen zu analysieren. Die Markierung mit GFP-Moleküle führt zu einem saubereren Hintergrund als Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Dextran (Ho und Kane 1990). Dies liegt daran...

E3 Ei Wasser: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mm CaCl 2 </li><li> 0,33 mm MgSO 4 </li><li> 0,1% Methylenblau </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

Cells ändern ausgiebig in ihren Standorten und Immobilien während der Embryogenese. Diese Veränderungen werden durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und ihrer Umgebung reguliert wird. Chimäre Embryonen, die aus Zellen verschiedener genetischer Hintergrund bestehen, sind großartige Werkzeuge, um die Zell-Zell-Interaktionen von Genen von Interesse vermittelt zu studieren. Die embryonale Transparenz der Zebrafisch am frühen Entwicklungsstadien ermöglicht die direkte Visualisierung der Morphogenese von Geweben und Organen auf der zellulären Ebene. Hier zeigen wir, ein Protokoll zu chimären Netzhaut und Gehirn in Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen und zu leben Bildgebung des Spenders Zellen durchzuführen. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung auf die Transplantation Nadeln, die Transplantation von GFP-exprimierenden Spender Blastomeren zu GFP-negative Hosts und die Prüfung der Spender das Verhalten der Zelle unter Live-konfokale Mikroskopie. Mit leichten Modifikationen kann dieses Protokoll auch verwendet, um die embryonale Entwicklung von anderen Geweben und Organen im Zebrafisch zu untersuchen. Die Vorteile der Verwendung von GFP zu markieren Spenderzellen werden ebenfalls diskutiert.

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Serie: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.