Die Technik ermöglicht es, die Funktion und den Umfang der Signalmoleküle während der Embryogenese durch Transplantation ektopischer Signalquellen zu untersuchen. Es erleichtert auch die effiziente Erzeugung von Keimbahnmutanten. Das Protokoll kann auf Zebrafische und Medaka-Embryonen im Blastula-Stadium und wahrscheinlich auch auf andere embryonale Stadien und TDO-Arten angewendet werden.
Um das Transplantationsgerät zusammenzubauen, schließen Sie eine 25 Mikroliter Gasdichtspritze mit Köderspitze mit der Köderschlossarmatur an einen Mikropipettenhalter an. Montieren Sie das Gerät dann direkt auf einem manuellen Mikromanipulator. Um das Transplantationsgerät zu verwenden, platzieren Sie den Mikromanipulator mit dem zusammengebauten Gerät neben einem Stereomikroskop.
Entfernen Sie dann den Kolben und führen Sie die Transplantationsnadel ein. Senken Sie die Nadel in eine mit Ringers Lösung gefüllte Schale in einem Winkel von 45 Grad ab, bis die Nadelspitze eingetaucht ist. Führen Sie den Kolben ungefähr zur Hälfte ein, um die Lösungen des Ringers auszuspülen, und lassen Sie nur ein kleines Wasservolumen in dem dünnen, sich verjüngenden Teil der Nadel.
Wenn Sie zum ersten Mal eine Transplantationsnadel verwenden, beschichten Sie die Innenseite der Nadel, indem Sie das Joch aus einem geopferten Embryo ziehen und das Jochmaterial vollständig ausstoßen. Als nächstes positionieren Sie mit einer Transplantationsnadel den Spenderembryo vorsichtig, positionieren Sie dann die Nadelöffnung orthogonal zur Embryooberfläche und ziehen Sie vorsichtig den Kolben, um die Zellen in die Nadel zu ziehen. Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen eingezogen ist, stoppen Sie den Saugvorgang, indem Sie den Kolben vorsichtig nach unten drücken und die Nadel aus dem Embryo entfernen, indem Sie die Nadel in einer kurzen und schnellen Bewegung zur Seite ruckeln.
Lassen Sie etwas Ringer-Lösung auf beiden Seiten der Zellsäule, indem Sie die Zellen auf das sich verjüngende Ende der Nadel beschränken. Beseitigen Sie verbleibendes Eigelb oder Zelltrümmer, indem Sie den Kolben langsam auf und ab bewegen und die Zellen mit Ringers Lösung waschen. Als nächstes bewegen Sie die Transplantationsschale mit der nicht dominanten Hand, um die Nadel orthogonal zur Oberfläche des Wirtsembryo zu positionieren.
Üben Sie leichten Druck auf den Embryo aus, indem Sie ihn vorsichtig gegen die Wände drücken. Durchbohren Sie dann mit einer schnellen scharfen Bewegung die umhüllende Schicht des Wirtembryos und achten Sie darauf, das Eigelb nicht mit der Nadel zu zerkratzen. Sobald sich die Nadel im Inneren befindet, drücken Sie vorsichtig den Kolben, um die Zellsäule in den Embryo zu extrudieren, und ziehen Sie die Nadel gleichzeitig langsam zurück.
Für die Transplantation von Keimzellen füllen Sie eine Transplantationsschale mit Ringers Lösung, übertragen Sie dann die dekarionierte Kugel zu Kuppelstadiumsembryonen in die Transplantationsschale und positionieren Sie den Wirt und die Spenderembryonen in abwechselnden Säulen, um die Zellen von einem Spenderembryo auf sechs verschiedene Wirtsembryonen zu transplantieren. Um die Transplantation durchzuführen, richten Sie die Embryonen mit dem Rand auf die Transplantationsnadel aus. Nehmen Sie für die Keimbahntransplantation die Quellzellen vom Rand und deponieren Sie sie an derselben Stelle im Wirtsembryo.
Sobald die Transplantation abgeschlossen ist, lassen Sie den Embryo sich in Ringers Lösung für 30 Minuten bis zu einer Stunde erholen. Untersuchen Sie dann mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop die transplantierten Zellen. Als nächstes übertragen Sie die Embryonen in eine 24 well Agarose beschichtete Platte mit Embryomedium, die alle Wirtsembryonen, die Zellen von derselben Spenderin erhalten haben, in die gleiche Vertiefung gruppiert.
Dann die Embryonen bei 28 Grad Celsius bis zum nächsten Tag inkubieren. Falls erforderlich, übertragen Sie die Spenderembryonen zur Genotypisierung in markierte PCR-Streifen. 30 Stunden nach der Befruchtung die Wirtsembryonen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf erfolgreiche Keimbahntransplantationen untersuchen.
Die Keimzellen sollten an der Rille oberhalb der Eigelbverlängerung vorhanden sein. Züchten Sie die erfolgreich transplantierte Larve bis zur Erwachsenenhaube gemäß den Standardhaltungsbedingungen. Bei erfolgreichen Transplantationen sieht der Embryo normal aus und ähnelt in Form und Eigelbklarheit untransplantierten Embryonen ohne große Risse im Blastoderm.
Im Gegensatz dazu, wenn ein Embryo während der Transplantation sichtbar beschädigt wird, wird er sich nicht normal entwickeln. Obwohl das Transplantationsgerät hauptsächlich bei Zebrafischembryonen im Blastulastadium eingesetzt wurde, kann die Transplantation und Zellausrottung auch in dehorionierten Blastula-Stadiumsembryonen des japanischen Reisfisch-Medaka durchgeführt werden. Im speziellen Fall der Keimbahntransplantation führt eine gute Transplantation zu einem Embryo mit einer langen horizontalen Zellsäule direkt über dem Eigelbrand.
Der Erfolg des Verfahrens kann jedoch erst nach 24 bis 30 Stunden Befruchtung beurteilt werden, wenn sich die Keimzellen in ihrer Fluoreszenz von somatischen Zellen unterscheiden. Die primordialen Keimzellen erscheinen als kleine fluoreszierende Kugeln in der Rille direkt über der Eigelbverlängerung. Das Vorhandensein dieser Keimzellen an der richtigen Stelle deutet auf eine erfolgreiche Keimbahntransplantation hin.
Beispiele für erfolglose Transplantationen werden hier gezeigt. Im ersten Beispiel haben die Keimzellen zwar das Gonadenmesoderm erreicht, da der Wirtsembryo stark deformiert ist, entwickelt er sich jedoch nicht normal. Im zweiten Beispiel werden fluoreszierende Zellen nur außerhalb der Rille detektiert.
Diese Zellen sind entweder körpereigene Zellen oder Keimzellen, die nicht richtig gewandert sind. Und beide Zelltypen tragen nicht zur Keimbahn des Embryos bei. Es ist wichtig, Schäden an den transplantierten Zellen und dem Wirtsembryo zu vermeiden.
Die Zellen sollten langsam aufgezogen, von verbleibendem Eigelb befreit und vorsichtig eingeführt werden. Diese Methode bietet eine einfache Möglichkeit, Zellen in Zebrafischembryonen zu transplantieren, und wird nützlich sein, um ektopische Quellen und Keimbahnmutanten zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieses Geräts ist, dass es kostengünstig ist und viel und verwendet.
