NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01426 Wir möchten Raquel Santos für die technische Unterstützung danken.

1. Systemische Delivery Methods Obwohl die systemische Verabreichung von Medikamenten ist nicht der effizienteste Ansatz für die Erreichung hoher Wirkstoffkonzentrationen im ZNS, sind systemische Lieferungen bequem und von den Patienten gut akzeptiert. Hier zeigen wir Ihnen, geeignete Verfahren für drei routinemäßig eingesetzt systemische Verabreichung Ansätze: intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und orale Gabe. A. intravenöse Injektion (Schwanzvene Injection) <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens sollte das Körpergewicht jede Maus aufgezeichnet werden. Wie bei allen präklinischen Studien sollte das Körpergewicht regelmäßig überwacht werden (zweimal pro Woche oder mehr), um potenzielle Toxizität von Medikamenten zu beurteilen. Nicht mehr als 1% der Maus das Körpergewicht in Volumen sollte ein einziges Mal injiziert werden. Zum Beispiel sollte nicht mehr als 0,2 ml Flüssigkeit in einer 20g-Maus injiziert werden. Alle Flüssigkeiten intravenös injiziert sollte durch eine geeignete Methode sterilisiert werden. </li><li> Die Maus sollte für 5-10 Minuten entweder mit einem Heizkissen oder eine Wärmelampe, die Schwanzvene erweitern erwärmt werden. Bei Verwendung einer Wärmelampe, überwachen die Maus jederzeit Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Die Maus ist eine Haltevorrichtung, die mit der Maus hemmt dabei den Zugriff auf die Schwanzvene (siehe Video) übertragen. In der Maus tail gibt es vier sichtbaren Gefäße: Die Gefäße auf der Rücken-und Seitenflächen sind Adern, und das Schiff auf der Bauchseite ist eine Arterie. Für den Zugriff auf die Schwanzvene, ist der Schwanz der Maus auf die distale Spitze gehalten, und um 90 Grad gedreht, so dass die Vene nach oben zeigt. Die Einstichstelle wird mit einem Alkoholtupfer gereinigt und 28g Insulinspritze eingelegt ist, abgeschrägte Seite nach oben in die Vene (siehe Video). Wenn die Nadel richtig in die Vene gelegt, sollte sie frei und ohne Druck bewegen. Spritzen Sie das Arzneimittel mit gleichmäßigem Druck über 5-10 Sekunden. Wenn eine Blase erscheint auf dem Schluss-, Brems injiziert, da dies bedeutet, dass die Nadel nicht mehr in die Vene. </li><li> Nach der Injektion sanften Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört. Dies dauert in der Regel 30-60 Sekunden. Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten nach der Injektion, um sicherzustellen, dass es keine weiteren Blutungen. </li></ol> B. intraperitoneale Injektion <ol><li> Vor Beginn der Injektion soll das Medikament in eine Spritze an einer 28g Nadel geladen werden. Stellen Sie sicher, dass es Raum in der Spritze zum Zeichnen Sie den Kolben vor der Injektion (z. B. wenn Injektion 200 ul, stellen Sie sicher, dass die Spritze Kapazität 300μL oder höher). </li><li> Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig von seinem Schwanz und legen Sie es auf eine strukturierte Oberfläche, so dass die Maus etwas zu greifen hat. Ein Käfig Deckel ist in der Regel ausreichend. Lassen Sie die Maus an den Körper dehnen und dann mit Ihrer nicht dominanten Hand, fassen Sie die Haut auf dem Rücken der Maus, wobei darauf zu leicht Prise so viel Haut wie möglich zwischen Daumen und Zeigefinger und Mittelfinger (siehe Video). Drehen Sie die Maus um, so dass der Bauch der Maus nach oben zeigt. Wenn die Maus frei bewegen können den Kopf, lassen Sie den Griff und versuchen Sie es erneut, um so zu verhindern, dass während der Injektion gebissen. </li><li> Mit Ihrer dominanten Hand, nehmen Sie die Spritze und die Nadel in einem 30 Grad-Winkel in den linken unteren Quadranten der Maus (siehe Video). Halten Sie die Maus leicht invertiert wird dazu beitragen, die Organe entfernt von der Injektionsstelle. Um sicherzustellen, dass die Nadel in die intraperitoneale Raum ist, zurückziehen auf den Spritzenkolben. Wenn keine Flüssigkeit oder Blut erscheint in der Spritze, dann wird die Nadel nicht in den intraperitonealen Raum und sollte entfernt werden. Wenn keine Flüssigkeit in die Spritze gesaugt wird, dann spritzen die Spritze Inhalte mit gleichmäßigem Druck über 1-5 Sekunden und lassen Sie die Maustaste. </li><li> Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Maus zu normaler Aktivität zurück. </li></ol> C. orale Gabe <ol><li> Vor Beginn der Injektion, und das Gewicht der Maus. Die maximale Lautstärke, die durch orale Gabe geliefert werden kann, ist 10 ml pro Kilogramm Körpergewicht. Zum Beispiel würde das maximale Volumen für ein 20g-Maus werden 200 ul. Der Versuch, größere Volumina zu injizieren kann in Rückfluss Dadurch wird die dazu führen können unvollständig Drug Delivery. Wenn es notwendig ist, um größere Volumina als oben angegeben zu verwalten, können so viele wie drei Dosen über 24 Stunden verabreicht werden. </li><li> Um zu vermeiden, Punktion der Speiseröhre, ist es wichtig, die Länge der Sonde Nadel für jede Maus zu messen. Halten Sie ein 18g Kugelspitze gebogene Sonde Nadel an der letzten Rippe der Maus, und markieren Sie dann die Länge an der Spitze der Maus den Kopf mit einem Permanent-Marker (siehe Video). Während der Magensonde, wird diese Marke ein Haltepunkt, wie Sie die Nadel in den Mund einführen der Maus verschoben werden. </li><li> Restrain der Maus mit den gleichen Handgriff für eine intraperitoneale Injektion. Legen Sie die Sonde Nadel in den Mund, über die Zunge, und ADVAnce die Nadel durch den Rachen. Stecken Sie nicht die Nadel hinter dem Anhalten zu markieren. Die Nadel sollte reibungslos ablaufen ohne Druck (siehe Video). Wenn Sie Druck begegnen, zu stoppen und ziehen Sie die Nadel zu vermeiden Einspritzen von Fluid in die Lunge. </li><li> Mit der Nadel in Stelle, drücken Sie den Kolben über 1-5 Sekunden und entfernen Sie dann die Nadel im gleichen Winkel, dass es eingefügt wurde. Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten, aufmerksam auf Anzeichen von Atemnot, die zeigen, dass Flüssigkeit in der Lunge gemacht hat, kann. </li></ol> 2. Local Delivery Akute Konvektion-Enhanced Lieferung A. Probe Construction Ein Rückfluss-resistente CED Kanüle für Nager ist noch nicht im Handel erhältlich. Hier zeigen wir Ihnen eine Methode zur Kanüle Konstruktion, die von einer Methode zuerst von Krauze et al (Krauze 2005) beschrieben angepasst wurde. <ul><li> Die Kanüle besteht aus drei Teilen (Abbildung 1): 100 um Durchmesser Kieselsäure Schläuche, durch die der Infusionslösung fließt, eine starre Metall-Nadel für die strukturelle Unterstützung und flexible Teflon-Schlauch für das Laden der Infusionslösung. </li><li> Um die starre Metall-Nadel, mit einer offenen Flamme, die aus Kunststoff auf einem Surflo IV-Katheter (24g Mandrin) schmelzen und mit einer Pinzette entfernen Sie die Nadel aus Metall. Der Rest des Katheters kann verworfen werden. Cut eine Länge von Silica-Schlauch (OD 0.163mm), etwas länger als die Metall-Nadel, mit einem Single-Rasierklinge. Die Rolle der Silica-Schlauch in einen kleinen Tropfen Cyanacrylat enthält, schnell wirkende Kleber (zB Krazy Glue), wobei darauf geachtet, keine Kleber an den Enden der Röhre zu bekommen. Legen Sie die Silica-Schlauch in der Metall-Nadel und lassen Sie für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Nach dem Trocknen sollte die Silica-Schlauch fest mit der Nadel befestigt werden. Die Enden der Kieselsäure entfernt werden sollen, so dass 2mm von Silica-Schlauch ragt aus dem spitzen Ende der Nadel und 3mm von Silica-Schlauch ragt aus dem flachen Ende (siehe Video). </li><li> Schneiden Sie einen Teil der Teflon-Schlauch 20 cm in der Länge. Rollen Sie die Metall-Nadel in einen kleinen Tropfen Kleber wieder dabei nicht zum Aufkleben auf die Enden der Silica-Schlauch zu bekommen, da dies die Kanüle verstopfen. Legen Sie die Nadel in die Teflon-Schlauch bis zu einer Tiefe von 1 cm. Lassen Sie für 1 Minute trocken. Mit einer Heißklebepistole, einen Tropfen Heißkleber auf die Verbindung zwischen dem Metall-Nadel und die Teflon-Schlauch (siehe Video). Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gelenk von allen Seiten bedeckt ist und lassen Sie für mindestens 1 Stunde trocknen lassen. Kanülen kann bis zu einer Woche im Voraus möglich und bei Raumtemperatur gelagert. </li></ul> B. Infusion Procedure <ul><li> Zur Vorbereitung der OP-Bereich, sollten alle Oberflächen mit einem Desinfektionsmittel, wie eine 2% ige Chlorhexidin-Lösung besprüht werden. Sterile OP-Handschuhe sollten während des Verfahrens zu tragen. Die Flächen werden dann mit einem saugfähigen Tüchern abgedeckt. Folgendes sollte in den OP-Bereich platziert werden: <ul><li> Heizkissen für Maus Körpertemperatur aufrecht zu erhalten </li><li> Zwei kleine Petrischalen, eine mit 3% Wasserstoffperoxid und einem Gehalt von 2% Chlorhexidin </li><li> Sterile Gaze und Wattestäbchen </li><li> Sterile Einweg-Skalpelle (Number 21) </li><li> Sterile Nadeln 22g </li><li> Maus stereotaktischen Rahmen </li><li> Controlled Rate Spritzenpumpe </li><li> Autoklaviert Mäusehaut Hefter, Heftklammern und Enthefter </li></ul></li><li> Zum Einrichten der CED Kanüle, fügen Sie eine 1-ml-Spritze mit dem Teflon-Schlauch mit einem Satz von Kunststoff-Spritze Adapter. Die Kanüle sollte der stereotaktischen Rahmen befestigt werden, so dass es senkrecht auf der chirurgischen Oberfläche (siehe Video). Zur Desinfektion der Kanüle, füllen Sie die 1-ml-Spritze mit 70% Ethanol und drücken Sie den Kolben auf die Ethanol durch die Kanüle laufen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer sterilen Kochsalzlösung, und auf eventuelle Lecks um die Kanüle Gelenke. Zur Desinfektion der Außenseite der Kanüle vorsichtig mit einem 70% igem Ethanol wischen wischen. </li><li> Füllen Sie die Kanüle mit steriler Kochsalzlösung und dann zurück ziehen auf Spritze, so dass eine kleine Luftblase in die Kanüle gezogen wird. Diese Luftblase wird der Infusionslösung aus der Kochsalzlösung in die Kanüle zu trennen. Dann tendieren, Ihre Infusionslösung (siehe Video). Die Spritze an die Spritzenpumpe und Pumpe entlüften durch kurzes Laufenlassen der Kanüle. </li><li> Sedate der Maus mit einem injizierten Anästhetikums und bereiten die Haut durch Abtupfen mehrmals (5-10 Sekunden) mit einem Stück steriler Gaze eingetaucht in die 2% Chlorhexidin-Lösung. Ophthalmic Salbe sollte die Maus aufgetragen werden, um ausreichende Feuchtigkeit während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Mit einem sterilen Skalpell, erstellen Sie eine sagittale Schnittführung entlang der Mittellinie des Schädels, etwa 1,5 cm lang (siehe Video). Der Schädel Oberfläche wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in eine 3% ige Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. Achten Sie darauf, zu vermeiden, Wasserstoffperoxid in den Augen der Maus. Die Naht Linien des Schädels sollte an dieser Stelle deutlich: wenn sie nicht sichtbar sind, sanft Tupfer den Schädel mit einem fresh Wattestäbchen in 3% Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. </li><li> Identifizieren Sie die Bregma (Abbildung 2) und messen Sie dann 2mm nach rechts und 1mm posterior dieser Struktur, um die Infusion Site zu suchen. Mit dem sterilen 22g Nadel, sanft erstellen ein Loch in den Schädel an dieser Stelle durch Drehen der Nadel gegen den Schädel (siehe Video). Vermeiden Sie zwingen die Nadel nach unten gegen den Schädel. </li><li> An diesem Punkt sollte die Maus in der stereotaktischen Rahmen platziert werden und beginnen Erhalt eingeatmet Betäubung (siehe Video). Verwalten der Narkose auf einem niedrigen Niveau (1%) und sorgfältig überwachen die Maus für Veränderungen in der Atemfrequenz, die Anpassung der Narkose entsprechend. </li><li> Position der Kanüle über den Schädel Loch und senken Sie dann 3 mm unterhalb der Kopfoberfläche. Beginnen Sie die Infusion mit den folgenden Raten und Laufzeiten: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 ul / min für 5 Minuten </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Gesamtvolumen 10 ul" /></td></tr><tr><td> 0,2 ul / min für 5 Minuten </td></tr><tr><td> 0,5 ul / min für 5 Minuten </td></tr><tr><td> 0,8 ul / min für 7,5 Minuten </td></tr><tr><td> OFF für 1 Minute </td></tr></tbody></table></li><li> Am Ende der Infusion langsam entfernen Sie die Kanüle und Tupfer des Schädels mit 3% Wasserstoffperoxid. Bewerben sterile Knochenwachs, um das Loch (siehe Video). Mit einer Pinzette, ziehen die Haut zusammen über den Schädel und heften sich zu schließen. Buprenorphin sollte für post-operative Schmerzlinderung verabreicht werden. </li><li> Überwachen Sie die Maus nach der Operation, bis er das Bewusstsein wiedererlangt und Mobilität. Aufgrund der Länge des Verfahrens, kann es bis zu einer Stunde für die Maus, um volle Aktivität wiederzugewinnen. Während dieser Zeit die Maus Käfig auf einem Heizkissen zu vermeiden, Hypothermie und nicht Haus der Erholung Maus mit anderen aktiven Mäusen. </li><li> Hautklammern sollten entfernt werden eine Woche nach der Operation. </li></ul> C. In Vivo Imaging Fluoreszenzmarkierten Infusionslösung kann nach CED Verwaltung abgebildet werden, und können auf Veränderungen in der Signalintensität sowie Signal Lage überwacht werden. In der Regel ist es am besten 2-3 Stunden nach der Infusion zu Bild warten, um damit die Maus, um aus der Infusion zu erholen. <ul><li> Für Anästhesie während der Bildgebung, verwenden Sie ein niedriges Niveau eines inhalativen Narkosemittel. Bewegen Sie die Maus, dorsale Seite nach oben in einem bildgebenden Station (zB IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Mit einem entsprechenden Filter-Einstellung für die Fluor, dass belichtet wird, erwerben Sie ein Bild. Für CED sollte eine erfolgreiche Infusion zeigen das meiste Material in das Gehirn in der Nähe der Injektionsstelle (Abbildung 3). </li></ul> 3. Repräsentative Ergebnisse Ein Mangel an Nebenwirkung der Gabe von Therapie ist ein wichtiger Indikator für eine erfolgreiche Injektion. Zum Beispiel folgende Schwanzvene Injektion sollte es keine Veränderung im Aussehen (zB Größe, Farbe) des Schwanzes werden. Eine Blase oder Blase folgenden Schwanzvene Injektion würde bedeuten, subkutane, anstatt intravenös, Lieferung der Therapie. Für intraperitoneale Injektionen, kann eine Beule auf der Haut oder Verfärbung des Bauches zeigen subkutane Injektion oder Schäden an inneren Strukturen. In orale Gabe, arbeitete eine Maus mit Atmen oder Husten kann darauf hindeuten, dass Flüssigkeit in die Lunge injiziert wurde, anstatt in den Magen. Für CED ist die neurologische Funktion für die Beurteilung der erfolgreichen Verwaltung der Therapie wichtig. Eine Maus, die ausstellenden Anfälle oder Hemiparese ist, kann eine falsche Infusion erhalten haben. Wenn eine fluoreszierende Infusionslösung verwendet wird, kann in-vivo-Bildgebung zur Beurteilung der erfolgreichen Verwaltung (Abbildung 3) angewendet werden. Wenn die Infusionslösung nicht an der Injektionsstelle lokalisierte, wurde die Infusion nicht erfolgreich. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: CED Kanüle und OP-Set-up. Die Grundelemente der Konvektion-enhanced Lieferung OP-Set-up gezeigt. Eine Mikroinjektion Pumpe (A) ist es, die Infusionskanüle beigefügt (B, gezeigt oben vergrößert). Ein stereotaktischen Rahmen (C) wird verwendet, um die Sonde Position. Dieses Bild enthält keine Heiz-und Anästhesie-Utensilien auch während des Verfahrens verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Maus Schädel Nahtlinien. Der CED Infusionsstelle (roter Stern) kann durch die Identifizierung der Schnittpunkt der sagittalen und koronaren Nähte (Bregma) und dann die Messung 2mm lateral und 1mm hinteren Teil des Bregma liegen. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus Erfolgreiche CED. Liposomes mit weit rot fluoreszierenden Farbstoff markiert wurden in das Gehirn der Maus mit CED infundiert und abgebildet in vivo und ex vivo. Eine erfolgreiche Infusion zeigt ein Fluoreszenz-Signal lokalisiert an den Ort der Infusion sowohl in vivo (A) und ex vivo (B). Das Signal sollte die Infusion Hemisphäre ohne Leckage in der kontralateralen Hemisphäre lokalisiert werden. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Repräsentative Image of Erfolgreiche CED in den Rat Hirnstamm. Fluoreszenzmarkierten Liposomen wurden in der Ratte Hirnstamm infundiert. Bei Ratten können so viel wie 20 &amp;mgr; l infundiert werden. Die erhöhte Dicke der Ratte Schädel und Tiefe der Injektion in vivo-Bildgebung ausgeschlossen, aber richtige Infusion Lage könnte durch Ex-vivo-Bildgebung des Gehirns seziert überprüft werden.

<ol>
	<li>Bobo, R. H., Laske, D. W., Akbasak, A., Morrison, P. F., Dedrick, R. L., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2076-2080 (1994).</li><li>Degen, J. W., Walbridge, S., Vortmeyer, A. O., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+convection-enhanced+delivery+of+gemcitabine+or+carboplatin+in+a+malignant+glioma+model+in+rats.">Safety and efficacy of convection-enhanced delivery of gemcitabine or carboplatin in a malignant glioma model in rats.</a> J Neurosurg. 99, 893-898 (2003).</li><li>Dickinson, P. J., LeCouteur, R. A., Higgins, R. J., Bringas, J. R., Roberts, B., Larson, R. F., Yamashita, Y., Krauze, M. T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Kirpotin, D. B., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+model+of+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+containing+CPT-11+monitored+with+real-time+magnentic+resonance+imaging:+laboratory+investigation.">Canine model of convection-enhanced delivery of liposomes containing CPT-11 monitored with real-time magnentic resonance imaging: laboratory investigation.</a> J Neurosurg. 108, 989-998 (2008).</li><li>Gill, S. S., Patel, N. K., Hotton, G. R., O'Sullivan, K., McCarter, R., Bunnage, M., Brooks, D. J., Svendsen, C. N., Heywood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+brain+infusion+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+Parkinson+disease.">Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease.</a> Nature Medicine. 9, 589-595 (2003).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+novel+therapeutic+agents+in+tumors:+physiological+barriers+and+strategies.">Delivery of novel therapeutic agents in tumors: physiological barriers and strategies.</a> J Natl Cancer Inst. 81, 570-576 (1989).</li><li>Krauze, M. T., Saito, R., Noble, C. O., Tamas, M., Bringas, J., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> J Neurosurg. 103, 923-929 (2005).</li><li>Krauze, M. T., Vandenberg, S. R., Yamashita, Y., Saito, R., Forsayeth, J., Noble, C. O., Park, J. W., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+real-time+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+to+primate+brain:+a+long-term+retrospective.">Safety of real-time convection-enhanced delivery of liposomes to primate brain: a long-term retrospective.</a> Exp Neurol. 210, 638-644 (2008).</li><li>Murad, G. J., Walbridge, S., Morrison, P. F., Garmestani, K., Degen, J. W., Brechbiel, M. W., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+image-guided,+convection-enhanced+delivery+of+interleukin+13+bound+to+pseudomonas+exotoxin.">Real-time, image-guided, convection-enhanced delivery of interleukin 13 bound to pseudomonas exotoxin.</a> Clin Cancer Res. 12, 3145-3151 .</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Szerlip, N. J., Walbridge, S., Yang, L., Morrison, P. F., Degen, J. W., Jarrell, S. T., Kouri, J., Kerr, P. B., Kotin, R., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> J Neurosurg. 107, 560-567 (2007).</li><li>Yamashita, Y., Krauze, M. T., Kawaguchi, T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Park, J. W., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+a+topoisomerase+I+inhibitor+(nanoliposomal+topotecan)+and+a+topoisomerase+II+inhibitor+(pegylated+liposomal+doxorubicin)+in+intracranial+brain+tumor+xenografts.">Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts.</a> Neuro Oncol. 9, 20-28 (2007).</li></ol>

Alle Verfahren gezeigt, hier wurden von der UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

Präklinische Beurteilung der Wirksamkeit eines therapeutischen Wirkstoffs muss berücksichtigt pharmakologischen Eigenschaften des Erregers und das Zielgewebe des Interesses zu nehmen. Während systemische Methoden der Verwaltung im Allgemeinen sind leicht und von den Patienten besser vertragen, die Selektivität der Blut-Hirn-Schranke erfordert häufig lokale Auslieferung der Therapie zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen. CED: Hier haben wir eine Methode zur direkten Abgabe an das Gehirn nachgewiesen. Andere Formen der lokalen Übermittlung an das Gehirn sind direkte Verabreichung an den Liquor, intratumorale Bolus-Injektion, und ventrikuläre Injektion. Für diese Verfahren ist Diffusionsfähigkeit von therapeutischen entscheidender Bedeutung, mit einer schlechten Diffusionsgrenzstrombereich der Region der Berichterstattung auf wenige Millimeter an der Injektionsstelle (Jain 1989, Bobo 1994). Im Gegensatz dazu nutzt CED positive Druck auf den Bereich der Verteilung von Medikamenten (Bobo 1994) zu erhöhen, während noch Therapien ermöglichen gezielt auf bestimmte neuroanatomische Strukturen. In unserem Labor haben wir erfolgreich durchgeführt in den Hirnstamm sowie in den caudatus Putamen bei Nagetieren (Abbildung 4) CED. Die Fähigkeit zur Durchführung CED in Nagermodellen immer wichtiger geworden in Verbindung mit zunehmenden Interesse an der Maximierung therapeutische Wirksamkeit bei der Behandlung von verschiedenen Arten von ZNS-Erkrankungen. CED lassen sich eine Vielzahl von Wirkstoffen, einschliesslich gereinigte Proteine, Medikamente aus kleinen Molekülen und Viren (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007) zu liefern. Das Spektrum der Krankheiten, die mit CED behandelt werden können, gehören Krebserkrankungen des zentralen Nervensystems (Yamashita 2007) sowie neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson (Gill 2003). Da CED Forschung weiter ausgebaut wird, die Notwendigkeit in-vivo-Bildgebung von CED-Therapie verabreicht wird ähnlich zu. Während die Fluoreszenz-Bildgebung zeigte sich hier wahrscheinlich nicht durch den menschlichen Schädel zu sehen, sind andere Methoden unter Verwendung von Co-Infusion von MRI-Kontrastmitteln (Dickinson 2008) das Interesse für die Beurteilung der Anwendbarkeit für die Überwachung der Infusionen bei Patienten mit ZNS-Erkrankung.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2% Chlorhexidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9756995</td>
<td>AKA &#x201C;Nolvasan&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>20g Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>28g Needle (with syringe)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-004-270</td>
<td>AKA Insulin Syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>H312P-4</td>
<td>Store away from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-400-100</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate-based Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9592632</td>
<td>AKA &#x201C;Krazy Glue&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Feather</td>
<td>2975</td>
<td>No. 21</td>
</tr>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22028563</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dunlap</td>
<td>HP950</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I.V. Catheter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-841-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infusion Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BASi</td>
<td>MD-1000, MD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Image Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>Contact for Quote</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic Ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cardinal Health</td>
<td>1272830</td>
<td>AKA &#x201C;Akwa Tears&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic Syringe Adaptors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td>
<td>Fits on Luer Lock Syringes</td>
</tr>
<tr>
<td>Silica Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin Stapler, Staples, Remover</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>59020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen Lumina</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>Contact for Quote</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

systemic and local drug delivery for treating diseases of the central nervous system in rodent models

Gründliche präklinische Testung des zentralen Nervensystems (ZNS)-Therapeutika enthält eine Betrachtung der Verabreichungswege und Agenten Bioverteilung bei der Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit. Zwischen den beiden großen Klassifikationen der Verwaltung, sind lokale vs systemische, systemische Verabreichung Ansätze oft bevorzugt wegen der Verwaltung zu vereinfachen. Allerdings kann die systemische Verabreichung in suboptimal Wirkstoffkonzentration in das ZNS erzielten Ergebnis und führen zu falschen Schlussfolgerungen hinsichtlich Agent Wirksamkeit. Local Drug-Delivery-Methoden sind invasiv, kann aber erforderlich sein, um therapeutische ZNS-Medikamenten zu erreichen. Hier zeigen wir die richtige Technik für drei Routen von systemischen Drug Delivery: intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und orale Gabe. Darüber hinaus zeigen wir eine Methode zur lokalen Übermittlung an das Gehirn: Konvektion-Enhanced Delivery (CED). Die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Verbindungen ist für In-vivo-Bildgebung und Überprüfung der ordnungsgemäßen Drug Administration enthalten. Die Methoden werden anhand von Mausmodellen, kann aber leicht für die Verwendung in Ratten angepasst werden.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Gründliche präklinische Testung von Medikamenten, die in das zentrale Nervensystem wirken oft mit der Beurteilung und den Vergleich von Medikament Bioverteilung in Verbindung mit bestimmten Arten der Verabreichung. Hier sind drei gängige Methoden der systemischen Verabreichung (intravenös, intraperitoneal, und mündlich) sowie eine Methode für die lokale Zustellung (Konvektion-Enhanced Delivery) bei Mäusen nachgewiesen.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

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30.2K Aufrufe.  University of California, San Francisco - UCSF. Gründliche präklinische Testung von Medikamenten, die in das zentrale Nervensystem wirken oft mit der Beurteilung und den Vergleich von Medikament Bioverteilung in Verbindung mit bestimmten Arten der Verabreichung. Hier sind drei gängige Methoden der systemischen Verabreichung (intravenös, intraperitoneal, und mündlich) sowie eine Methode für die lokale Zustellung (Konvektion-Enhanced Delivery) bei Mäusen nachgewiesen.

Serie: Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Eine computergesteuerte Testbatterie Pharmakodynamische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem cholinerge Medikamente in der frühen Phase Medikamentenentwicklung zu studieren

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...