Wir möchten Curt Mazer von Isis Pharmaceuticals danke für die Beratung im Zusammenhang mit der ICV Bolus Chirurgie sowie Isis Pharmaceuticals als Ganzes für die Versorgung unserer Labor mit ASOs. Weiterhin möchten wir Carey Shaner für die Durchsicht dieses Artikels danken. TMM und SLD durch NIH Grants P50AG005681, K08NS074194 und R01NS078398 unterstützt.

Das Protokoll wurde von der unten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der Washington University in St. Louis genehmigt worden und ist in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren. Wenn dies Ihr erster Zeit Durchführung Operationen, empfehlen wir bei der JoVE Artikel auf Nagetier Operationen als Einführung vor Beginn 14 suchen. ASOs an die Maus CNS sowohl durch osmotischen Pumpe Infusion und einer einzigen ICV Bolus-Injektion geliefert werden. Aus diesem Grund wird das Verfahren ausführlich unten in zwei Segmente unterteilt. Vor-und Nachteile der jeweiligen Methode fällt auf in der Diskussion Abschnitt berührt werden. Die Koordinaten in der verwendeten Protokolle sind für Erwachsene und C57BL6 B6C3 Mäusen. Entsprechende Ratte Koordinaten können in Tabelle 1 zu entnehmen. ALZET osmotische Pumpe 1. Herstellung von Alzet osmotische Pumpen <ol><li> Legen Sie eine sterile drape und vorsichtig fallen die folgenden Elemente auf, während es dabei nicht direkt anfassen, um die Sterilität zu wahren: osmotische Pumpe (n), Flow Modulator (en), 1 ml sterile Spritze (n), Skalpell, und Abschnitte der Rohrleitung (1 Stück Schlauch = 5 Pumpen). Bei Mäusen, gibt es drei Möglichkeiten für Pumpen: 14 Tage, 28 Tage, und 42 Tage (Abbildung 2A). </li><li> Die Kappe und füllen sterile 50 ml konische Röhrchen mit 15-20 ml Kochsalzlösung. Bis zu 6 montierten Pumpen können pro konische Röhrchen gegeben werden. </li><li> Füllen Sie eine p60 Petrischale mit 100% Ethanol. In entsprechenden Anzahl von Kathetern zum Ethanol. Bei Mäusen ist Katheterlänge 2,5 mm. </li><li> Filter wird jedes ASO in so viele 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wie nötig. Fügen Sie ein Eppendorf-Röhrchen mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung gefüllt, um den Schlauch mit zu füllen. </li><li> Wenn alles bereit ist, auf sterile Handschuhe anziehen. Achten Sie darauf, nicht auf alles, was nicht steril zu berühren. Wechseln Sie die Handschuhe nach Bedarf. </li><li> Für jede ASO verwendet werden, füllen eine 1 ml Spritzeund loadpumps indem Sie die Nadel in das obere Loch und langsam füllen, bis überschüssiges austritt. Weiter, bis alle Pumpen gefüllt sind. </li><li> Uncap die Fließeigenschaften-Modulatoren und legen in den Pumpen. Schieben Sie den Flow-Modulator fast alle den Weg in, so dass ein 3-5 mm Lücke. </li><li> Mit dem Skalpell, schneiden jedes Stück Schlauch in 5 gleich große Segmente. Nehmen Sie ein Stück Schlauch, mit steriler Kochsalzlösung unter Verwendung einer 1 ml Spritze zu füllen, und legen Sie die Spitze des Flussregulierungsvorrichtung in ein Ende des Schlauchs. Dann nehmen Sie eine Kanüle aus dem Ethanol und verbinden Sie es mit dem anderen Ende des Schlauchs. Die Pumpe ist nun fertig konfektioniert. </li><li> Legen Sie das komplett montierte Pumpe in den sterilen 50 ml konischen Röhrchen mit Kochsalzlösung zur Grundierung. Die Grundierung kann für die Pumpen aufzusaugen Fluid in die Arzneimittelabgabe einzuleiten sowie kommen auf die richtige Temperatur. Priming Zeit: 14 Tag Pumpen: 4-6 Std., 28 Tage Pumpen: 40 Stunden, 42 Tage Pumpen: 60 Std. Wenn Sie fertig sind die Montage der Pumpen, krönen die konische Röhrchen und in einer sauberen37 ° C Wasserbad bis zur Operation. </li></ol> 2. Pre-chirurgische Verfahren <ol><li> Wischen Sie alles auf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren und hinlegen sterilen Tüchern auf der Tischplatte und stereotax einen sterilen Bereich zu erstellen. Es ist wichtig, aufmerksam zu sein von den sterilen Bereich während der gesamten Operation. Schalten Sie die folgenden Schritte aus: Bead Sterilisator, Heizkissen, Licht, Digitalanzeige und Sauerstoff / Isofluran-System (Abbildung 1). </li><li> Die folgenden Punkte werden benötigt, wenn dadurch entweder eine einzelne Operation oder eine ganze Serie von Operationen, wie wir routinemäßig tun: 1 Pinzette, 1 gebogene hemostat, 1 Paar kleine Schere, 1 Paar kleinen gebogenen stumpfen Schere, 1 Ratte Knochenfräser , 1 gerades hemostat, 5-0 Nylonnaht, 1 konische Röhrchen mit 70% Ethanol, 1 konischen Rohr mit 95% Ethanol, 1 konischen Rohr mit Jod 1 konische Röhrchen mit Wasserstoffperoxid, Packung sterile Wattestäbchen, 1 Flasche Super Kleber, 1 Tube antibiotische Salbe, 1 Tube AugeSchmiermittel und 1 elektrischen Rasierer. </li><li> Stecken Sie die Enden der beiden Paare von Scheren, Pinzetten und gekrümmten hemostat in den Wulst Sterilisator für 15 sek. Entfernen und legen in 70% Ethanol. Bei der Durchführung von mehr als einer Operation erneut sterilisieren die Spitzen der Instrumente zwischen den Tieren. </li><li> Schalten Sie die Isofluran auf 4% und O 2 zu 0,4 l / min und direkte Gasstrom in die Kammer. Wir haben unsere Isofluran / Sauerstoff-System kalibriert mindestens einmal pro Jahr, um sicherzustellen, dass wir liefern die richtige Menge der Anästhesie. Bewegen Sie die Maus in der Kammer und warten, bis die Atmung deutlich verlangsamt. Entfernen Sie die Maus, und führen Sie eine Zehe Prise, um sicherzustellen, die Maus ist völlig unbewusst. </li><li> Rasur das Haar von der Spitze der Schulter bis in zwischen den Augen. Wenn die Maus beginnt zu erwachen, platzieren Sie den Mauszeiger in die Kammer zurück, bis die Maus ist wieder völlig unbewusst, Bestätigung mit einer Zehe Prise. Setzen Sie den narkotisierten Maus auf dem stereotax und drücken Sie die Nase Kegel über der Nase.Sei sanft wie die Zähne und Knochen brüchig sind. </li><li> Richten Sie den Gasstrom zum stereotax halten die Maus narkotisiert. Es ist wichtig, gelegentlich zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Maus ist völlig unbewusst mit einer Zehe Prise während der Operation. Sichern Sie den Kopf mit den Ohr Bars. Wir bevorzugen Nivellierung Ohr Bars, obwohl die lateralen Ventrikel zielen, ist eine perfekt Ebene Schädel nicht notwendig aufgrund der großen Größe der Ventrikel. </li><li> Schalten Sie die Isofluran Ebene bis hinunter zu 2,0% für die Wartung. Dab Augensalbe auf jedes Auge. Wie in dem Video, legen ein steriles Tuch über die Maus, so dass nur die Basis des Halses und des Kopfes ausgesetzt sind. Dann desinfizieren OP-Bereich durch Abwischen der Oberseite des Kopfes und Halses in einer kreisförmigen Bewegung ab der Mitte der Fläche rasiert und Bewegen nach außen zunächst mit einem Wattestäbchen in 95% Ethanol getaucht, gefolgt von einem Wattestäbchen in Jod getaucht. </li><li> Wir empfehlen die Verwendung eines Rektalsonde Feedback temperaturgeführte Heizsystem, das sorgt fürdie Temperatur der Maus bleibt auf einem stabilen 37 ° C. Wenn die Temperatur der Maus nimmt während der Operation, kann die postoperative Erholung länger dauern und die daraus resultierende Hypothermie können abweichende Protein-Aktivität führen, einschließlich Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau 15. Nach dem Einrichten der Heizungsanlage, sind Sie nun bereit, um die Operation zu beginnen. </li></ol> 3. Implantation von Alzet osmotische Pumpe <ol><li> Vor Beginn der Operation auf ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen. Dann wird unter Verwendung einer Pinzette und eine kleine Schere, einen Einschnitt in die Haut von der Basis des Halses oberhalb des Tieres Schädel in zwischen den Augen </li><li> Nehmen Sie die abgestumpften Schere mit der Kurve nach oben und unten gleiten die Haut an der Basis des Halses wieder nach links Hinterbein. Es sollte kein Widerstand. Falls ja, entfernen Sie die Schere und versuchen Sie es erneut. Dies bildet die subkutane Tasche für den osmotischen Pumpe. </li><li> Wipe der Schädel sauber mit sterilen Wattestäbchen, von einem Wattestäbchen gefolgt eingetaucht in Wasserstoffperoxid zu Bregma verbessern. </li><li> Wischen Sie die 50 ml konische Röhrchen, die Pumpen enthalten, um die Sterilität der Pumpen zu halten. Sie vorsichtig eine Pumpe aus dem konischen Rohr mit dem gekrümmten hemostat unter besonders vorsichtig, dass die Pumpe nicht berühren die Seiten des konischen Rohrs. Halten Sie den Boden der Pumpe mit einer Zange und drücken Sie den Flussregulierungsvorrichtung in den Rest des Weges mit dem gekrümmten hemostat. </li><li> Halten Sie die Pumpe, wo die Strömung Modulator und Schläuche erfüllen mit dem gekrümmten hemostat. Legen Sie die Pumpe unter die Haut an der Basis des Halses und schieben Sie es zurück in Richtung der linken Hinterbein soweit es ohne Widerstand zu gehen. Achten Sie darauf, sich nicht die Katheter Touch nichts. </li><li> Mit dem gekrümmten hemostat, greifen die Kanüle an der Nut, wo die obere trifft den Sockel. Bewegen Sie die Kanüle Fahrer in Position und sichern einrastet. </li><li> Legen Sie eine einzelne Tropfen Superkleber auf der Basis der Kanüle. Push die Spitze der Kanüle in den Fahrer und Position, so dass der Schlauch gerade nach hinten gerichtet ist. </li><li> Tippen Sie auf die Katheterspitze Bregma und Null die Koordinaten auf dem Digital-Display. Heben Sie den Katheter und bewegen 1,1 mm seitlich nach rechts und 0,5 mm posterior (Abbildung 2B). Halten Sie die Haut aus dem Weg mit dem gekrümmten hemostat. </li><li> Fahren Sie mit dem dünnen Metall-Katheter durch den Schädel, bis die Kunststoffkanüle Basis fest gegen die Oberseite des Schädels gedrückt. Die Metall-Katheter kann direkt durch den Schädel getrieben werden in Mäusen aufgrund der relativen dünnen Schädel. Bei Verwendung von Ratten, bohren Sie ein Loch in den Schädel vor dem Absenken des Katheters. </li><li> Ziehen Sie jede Haut, die Kleber auf sie hat vom Schädel. Mit der Kanüle Fahrer hält die Kanüle / Katheter in Ort, warten 1-2 min bis der Kleber vollständig trocknen. </li><li> Beim Üben zu Katheterplatzierung beurteilen, injizieren 20-40 ul 2,5% FastGreen Dye durch den Schlauch (Abbildung 2C). Warten Sie 2-3 min, perfuse die Maus mit 1X PBS 0,03% Heparin, und entfernen Sie das Gehirn. Cut koronal am Katheter Website. Wenn der Katheter im Ventrikel platziert wurde, wird der Farbstoff in der Maus Ventrikelsystems (2D) durchströmt zu werden. </li><li> Halten Sie den Katheter an Ort und Stelle mit dem gekrümmten hemostat gleichzeitiger Erhöhung der Fahrer. Langsam den hemostat um sicherzustellen, dass die Kanüle richtig mit dem Schädel befestigt. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, drücken Sie auf die Oberseite der Kanüle. Montieren Sie die Rattenknochen Clippers in den Wald zwischen dem Ober-und Unterteil der Kanüle. Clip aus der Spitze der Kanüle während noch nach unten drücken mit dem Wattestäbchen. Versuchen Sie, und halten Sie die Clippers Ebene, um nicht die Kanüle aus dem Schädel zu lösen. Wenn die Kanüle kommen unglued hat, schnell wieder Leim und Druck mit einem Wattestäbchen für weitere 2 min. </li><li> Mit dem 5:0-Faden, regelmäßige hemostat und Pinzetten, Naht entlang der vollständigen Öffnung, die ihr besonderes Augenmerk rechts über die Kanüle. Wir verwenden eine Running horizontal Matratzennaht (siehe Abbildung 5) aufgrund der größeren Einschnitt über den Schädel. </li><li> Tragen Sie einen Klecks von antibiotische Salbe über den Kopf und Hals. Lösen Sie das Ohr Bars und lösen Sie die Nase Kegel. Entfernen Sie die Maus vom stereotax und auf eine Erwärmung pad für die Verwertung. Überwachen Sie die Mäuse eng für die Dauer der Erholung, in der Regel im Bereich von 10-30 Minuten. Überprüfen Sie alle 2-3 Minuten, bis die Maus beginnt herumlaufen und sich pflegt. </li></ol> 4. Postoperative Pflege <ol><li> Überwachen Sie die Mäuse täglich nach der Operation für die erste Woche. </li><li> Wenn eine Maus scheint in Schmerzen oder Leiden zu sein, empfehlen wir die Bereitstellung der Maus mit einer 5 mg / kg subkutane Injektion von Carprofen einmal 24 Stunden für bis zu 5 Tage, um die Schmerzen zu lindern. </li><li> Wenn es scheint, eine Infektion sein, großzügig auftragen antibiotische Salbe auf den Bereich täglich konsultieren behandelnde Tierarzt, um sicherzustellen, dass die Wunde richtig heilt. </li><li> Rallen, um die 5-0 Nylonnaht 7-10 Tage nach der Operation zu Irritationen aus dem Faden zu verhindern. </li></ol> 5. Ändern oder Entfernen Alzet osmotische Pumpe Nachdem die Pumpe erfolgt aktiv Infusion ASO, kann es entweder verändert oder vollständig entfernt. <ol><li> Folgen Sie der gleichen pre-Chirurgie Verfahren wie oben mit folgenden Änderungen: 1) brauchen Sie nicht die gekrümmte Schere, gebogen hemostat, Ratte Knochenfräser noch die Digital Display und 2) statt prepping den Kopf der Maus, rasieren und Desinfektion der Rückseite der Maus an der Verbindung der Pumpe und Rohrleitung. </li><li> Machen Sie eine 1,5 cm Einschnitt auf der Rückseite der Maus, die senkrecht an der Pumpe / Schlauch Kreuzung mit einer Pinzette und Schere. Ziehen Sie die Pumpe aus dem Einschnitt ohne deutlich Ziehen / Schieben auf dem Schlauch, da sie die Katheter kann jar. </li><li> Um die Pumpe zu entfernen, befestigen Sie den Schlauch etwa 0,5 cm oberhalb des Flussregulierungsvorrichtung und berühren Sie die Sekundenkleber auf den Schlauch to Dichtung es geschlossen. Warten Sie 1-2 Minuten bis der Kleber trocknen. Legen Sie den Schlauch wieder in den Schnitt und Naht geschlossen. Dab antibiotische Salbe auf die Haut vernäht und platzieren Sie den Mauszeiger auf einem beheizten Erholung Pad. </li><li> Um die Pumpe zu ändern, haben frisch zubereiteten Pumpen bereit zusammen mit einer 10 cm Schüssel mit 95% Ethanol gefüllt. Katheter werden nicht mit den neuen Pumpen benötigt. </li><li> Schnappen Sie sich eine neue Pumpe mit der Pinzette. Tauchen Sie Ihre Finger in die Ethanol, greifen Sie in die Pumpe, und entsorgen Sie die Flow-Modulator. Dann vorsichtig und langsam abziehen alte Pumpe aus dem Strom-Modulator an den Schlauch und Kanüle. Sobald es ausgeschaltet ist, langsam schieben Sie die neue Pumpe auf, sicherzustellen, dass die Flussregulierungsvorrichtung berührt niemals die außerhalb der Maus. </li><li> Setzen Sie die neue Pumpe durch den Einschnitt in die subkutane Naht Paket und die Haut. Dab antibiotische Salbe auf die Wunde und Ort Maus auf Erholung Pad. </li><li> Genau wie bei der Pumpe Implantation, überwachen die Mäuse täglich nach der Operation für p prüfenain / Beschwerden und Infektionen. Gönnen mit Carprofen und Antibiotika als notwendig erachtet wird. </li></ol> ICV BOLUS 6. Pre-chirurgische Verfahren <ol><li> Folgen Sie dem gleichen Verfahren vor der Operation, wie in Abschnitt 2 oben mit folgenden Änderungen: 1) brauchen Sie nicht gekrümmte Schere, gebogen hemostat oder Ratte Knochenfräser; 2) sauber ein 10 ul Hamilton-Spritze und Nadel mit sterilem Wasser und Last mit ASO und 3) ist, die Spritze und Nadel auf den stereotaktischen Apparat, wo die Kanüle Fahrer befand. </li></ol> 7. Bolus-Injektion von ASO <ol><li> Mit einer Pinzette und eine kleine Schere, einen Einschnitt von der Basis des Halses bis zu zwischen den Augen. </li><li> Wischen Sie den Schädel sauber mit sterilen Wattestäbchen, von einem Wattestäbchen in Wasserstoffperoxid getaucht, um Bregma verbessern gefolgt. </li><li> Bewegen Sie die Spritze / Nadel in ein und sichern. Stellen Sie sicher, dass die abgeschrägte Teil der Nadel hinteren Gesichter. Senkendie Nadel bis sie berührt Bregma. Null alle Koordinaten. Bewegen der Nadel seitlich nach rechts 1,0 mm und 0,3 mm vorderen (3A). </li><li> Langsam fahren die Nadel durch den Schädel nur, bis die Nadel Loch bündig mit der Oberseite des Schädels. Auch dies kann aufgrund der geringen Dicke der Maus Schädel erfolgen. Null die z-Koordinate und Senken der Nadel bis -3,0 mm mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / sec (3B). Warten Sie 2-3 Minuten für das Gehirn um die Nadel zu versiegeln. </li><li> Liefern Sie den vollen 10 ul ASO mit einer Rate von 1 ul pro Sekunde. Warten Sie 2-3 min. Wir verwenden eine 1 ul Infusionsrate für ASOs in die Herzkammer, obwohl diese Rate zwischen verschiedenen Drogen unterscheiden können. Beim Üben für die richtige Platzierung der Nadel durch die Bereitstellung überprüfen 10-20 ul 2,5% FastGreen Dye. Versorgen die Maus mit 1X PBS 0,03% Heparin bald nach Farbstoff Infusion und machen Kranzschnitte des Gehirns, um zu überprüfen, dass der Farbstoff in der ventrikulären System (3C) ist. </li> &lt;li&gt; Halten Sie ein Wattestäbchen gegen den Schädel an der Basis der Nadel. Heben Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 1 mm pro Sekunde. Sobald die Nadel außerhalb des Schädels, rollen die Wattestäbchen über die Nadel Loch und halten Sie für 1 min, jede ASO Austreten zu verhindern. </li><li> Naht der Haut geschlossen, gelten antibiotische Salbe und Ort Maus auf beheizten Erholung Pad. Je nach Konzentration ASO, kann es 20 Minuten, um ein paar Stunden dauern, um sich vollständig zu erholen. </li><li> Genau wie bei der Pumpe Implantation, überwachen die Mäuse täglich nach der Operation für Schmerzen / Beschwerden und Infektionen zu überprüfen. Gönnen mit Carprofen und Antibiotika als notwendig erachtet wird. </li></ol>

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Die Autoren erhalten ihre Antisense Oligonukleotide von Isis Pharmaceuticals.

Die Fähigkeit, global zu liefern Drogen im ZNS, wie in dem Video zu sehen ist eine äußerst leistungsfähige Technik, die einfach zu erlernen und zu bedienen beide ist. Mit etwas Übung kann eine einzelne Pumpe oder eine Implantation ICV Bolus in 10 min abgeschlossen sein, so dass für große Kohorten von Mäusen zur gleichen Zeit behandelt werden. Dies ist besonders nützlich für Studien mit einer Verhaltens-Anzeige, wie eine größere Anzahl für Mausverhalten kritisch, um zu einer wesentlichen Unterschiede. Basierend auf unseren Erfahrungen liefern ASOs über Pumpen und Bolus-Injektionen, haben wir einige Vor-und Nachteile jeder Methode beobachtet. Es sollte angemerkt werden, dass diese die Meinungen in unserem Labor sind und möglicherweise nicht für alle Maus und Ratte Modelle wahr werden. Wir finden, ein Vorteil der Verwendung der Pumpen ist ihre Fähigkeit, eine große Menge an ASO, da die ASO über einen viel längeren Zeitraum verteilt liefern. Diese Regel entspricht länger anhaltende Knockdown oder Spleißen nach aktiverASO Infusion, obwohl dies nicht immer der Fall sein. Die Pumpen ermöglichen auch einen genauen Zeitrahmen von ASO Lieferung (14 Tage, 28 Tage, oder 42 Tage) und die Pumpen einmal geändert werden, um für noch mehr aktiv ASO Infusion zu ermöglichen. Wir haben jedoch festgestellt, dass eine Änderung Pumpen mehr als einmal erhöht die Variabilität aufgrund der Bildung von faserigen Taschen um die Pumpe, die Pumpe ordnungsgemäß Absorptionsflüssigkeit zu verhindern. Ein Nachteil der Pumpen ist, dass einige Mäuse nicht dulden, die Pumpe sowie andere. Wenn die transgene Linie mit dem Sie arbeiten ist zerbrechlich, kann eine Pumpe zu umständlich. Die Pumpen müssen auch nach dem letzten Infusion entfernt werden, unterwirft die Mäuse zu einer anderen Operation und Anästhesie added. Wenn dabei Verhalten zu umgehen, ist es besonders wichtig, um die Pumpe zu entfernen und damit für mindestens 1-2 Wochen der Erholung, da die Anwesenheit der Pumpe einige Verhaltensweisen in den Mäusen beeinflussen. Mit ICV Bolusinjektionen ist ein Vorteil Kosten. Es ist einVorab-Investition zum Kauf der Spritzen und Nadeln, aber im Laufe der Zeit, sind Bolusinjektionen kostengünstiger, da keine Pumpen / Schläuche / Katheter zu erwerben sind. Insgesamt gibt es weniger mit den ICV Bolusinjektionen aufgrund des Fehlens von Kanülen und pumpt-halten. Wir finden auch, dass ICV Bolus verwendet werden, um ASOs zu jüngeren und / oder anfälliger Mäuse liefern werden. Ein Nachteil des ICV Bolus ist, dass es nur eine Injektion. Nicht so viel, insgesamt ASO kann auf diesem Weg geliefert werden, und wenn die Wirkdauer des ASO verwendet ist kurz, die Knockdown / Spleißen Effekte werden auch von kurzer Dauer sein. Sowohl die osmotische Pumpen sowie die ICV Bolus haben die Fähigkeit, ASOs liefern, dass Can Knockdown Proteine ​​oder ändern Spleißen von Genen im gesamten ZNS Nagetier, eine Technik, die breite Anwendungen in mehreren verwandten Bereichen Neurowissenschaften hat. Wir empfehlen Pilotierung beide Methoden der Lieferung, wenn Sie unsicher sind, welche Art der Verabreichung ist am besten geeignet für Ihre specific Studie.

Einige Medikamente sind nicht in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überqueren, mit direkter Zentrales Nervensystem (ZNS) Lieferung. Um die BBB umgehen können Medikamente direkt in das Gehirn mit Hilfe der beschriebenen Verfahren geliefert werden. Während unser Labor und das Papier detaillierte hierin Fokus auf Antisense Oligonukleotide (ASO), können auch andere Drogen, wie kleine Moleküle, Antikörper, Gentherapie-Vektoren, etc., Auch durch die exakt gleiche Ansatz geliefert werden. Bestimmte Proteine ​​spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Proteine ​​bilden oft giftige Spezies und sammeln zu Aggregaten, was zu möglichen neuronalen Tod und die anschließende neurologische Erkrankung 3-4. In dem Bemühen, zu verlangsamen oder sogar stoppen das Fortschreiten dieser Erkrankungen kann eine therapeutische Option sein, das direkt auf und verringern die ursächliche Protein. Allerdings sind diese Proteine ​​oft ubiquitär durch die ZNS, was es schwierig macht e<html> ffectively zielen sie auf einer globalen Skala. Um Gene während der gesamten CNS Ziel verabreichen wir ASOs in Maus-Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) über den lateralen Ventrikel die BHS zu umgehen. Diese spezielle Methode nutzt die Maus ventrikuläre System, das das gesamte Gehirn und Rückenmark umspült, so dass weite Verbreitung der ASOs. Wir verwenden die ASOs 18-20 mer RNA-Moleküle binden, die direkt die Ziel-mRNA-Sequenz sind, und je nach der ASO chemische Modifikationen, entweder A) rekrutieren RNase-H, die mRNA, die zu Knockdown verschlechtern oder B) verschieben alternatives Spleißen 1 , 2,16,17. Es sei darauf hingewiesen, dass mehrere Moleküle für das Klopfen ein spezifisches Protein in vivo, einschließlich shRNA existieren. Da diese Moleküle nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, richten wir den Leser auf Artikel bewerten, dass eine bessere Detail Knockdown Wirkmechanismen und die Vorteile / Nachteile der einzelnen 5-6. jove_content &quot;&gt; In früheren Arbeiten haben wir ASOs verwendet werden, um an die Protein Superoxiddismutase 1 (SOD1) in einem transgenen Rattenmodell Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) 7 (Abbildung 4). Mutationen im SOD1 treten bei etwa 2% aller ALS 8 Fälle, obwohl es wurde vor kurzem vermutet, dass SOD1 kann eine wichtige Rolle bei sporadischen ALS sowie 9-10. spielen Durch Verringern insgesamt SOD1 Ebenen in der ALS transgenen Ratte, das Überleben nach Beginn wurde deutlich 7 erhöht. Diese wichtigen Daten waren die ersten zu zeigen, dass eine Behandlung ASO im ZNS könnte eine tiefgreifende positive Auswirkungen auf eine neurologische Erkrankung Modell haben. Seitdem ASOs gezielt auf menschliche SOD1 eingegeben haben und absolvierte erfolgreich eine Phase-I-Studie mit menschlichen minimalen Nebenwirkungen (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , wie bei der 2012 64. Jahrestagung der American Academy of Neurology vorgestellt. Pläne, die ASOs vorwärts bewegen, um II-Studien der Phase sind derzeit im Gange. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Während Targeting SOD1 war die erste Demonstration der Verwendung ASOs eine neurologische Erkrankung zu behandeln, verschiedene andere Studien wurden seitdem durchgeführt Betrachtung der verschiedenen Krankheiten und deren Zielproteine. In 2010 und 2011, dass ASOs Verschiebung Spleißen des Protein Überleben von Motoneuronen 2 (SMN2) wurden in transgenen Mausmodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA) verwendet und führte zu einer signifikanten Verbesserung der Krankheitsphänotypen 11,12. Diese Spleißen ASOs sind jetzt in Phase I der klinischen Studien bei Kindern mit SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass transiente Verwaltung ASOs gegen die Huntingtin-Gen gezielt in der Lage dramatisch zu retten das Huntington-Mausmodell waren, selbst nachdem die Huntingtin-Protein-Spiegel zu Studienbeginn 13 zurückgegeben. In all diesen Studien wurden ASOs zu den lateralen Ventrikel geliefert gesamten Gen-Spiegel senken oder zu verändern durch Gentechnologiedie gesamte ZNS. Beide osmotische Pumpen und eine einzelne Bolusinjektion kann verwendet werden, um ASOs der CSF zu liefern. Pumpen ermöglichen eine langsame, kontinuierliche Lieferung, während die intracerebroventricular (ICV) Bolus ist eine schnelle, einmalige Injektion. Wir haben diese beiden Methoden mit Erfolg eingesetzt, obwohl wir nicht den direkten Vergleich zwischen Pumpe und Bolus in einem transgenen Linie haben berichtet. Mit ASOs im ZNS ist eine leistungsfähige Methode, um insgesamt Protein-Ebene und / oder Veränderung Spleißen mehrerer Proteine ​​zu verringern. Während wir ASOs ausschließlich zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, erkennen wir, dass in anderen Bereichen kann auch von dieser Technik profitieren. Solange das Protein von Interesse wird im ZNS exprimiert und das ultimative Ziel ist es, CNS-weiten Veränderungen in der Genexpression, mit ASOs in den gezeigten Techniken zu erreichen, kann sehr nützlich sein.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

Aufgrund der Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, müssen bestimmte Medikamente direkt in das Zentralnervensystem (ZNS) geliefert werden. Unser Labor konzentriert sich speziell auf Antisense-Oligonukleotide (ASO), obwohl die Techniken in der hier gezeigten Video kann auch verwendet werden, um eine Vielzahl von anderen Drogen, um das ZNS zu liefern. Antisense-Oligonukleotide (ASO) die Fähigkeit haben, Knockdown sequenzspezifische Ziele 1 sowie Verschiebung Isoform Verhältnisse von spezifischen Genen 2. Um weit verbreitete Gen Knockdown oder Spleißen im ZNS von Mäusen zu erreichen, können die ASOs in das Gehirn über zwei separate Wege der Verabreichung, die beide zeigen wir im Video geliefert werden. Die erste Verwendung Alzet osmotische Pumpen, die mit einem Katheter, die chirurgisch in den lateralen Ventrikel implantiert wird. Dadurch können die ASOs kontinuierlich in das ZNS für eine festgelegte Zeit infundiert werden. Die zweite besteht aus einer einzigen Bolus-Injektion von einem hallogh Konzentration von ASO in den rechten lateralen Ventrikel. Beide Verfahren verwenden die Maus zerebralen Patienten, um die ASO auf das gesamte Gehirn und Rückenmark liefern, obwohl je nach den Bedürfnissen der Studie eine Methode gegenüber der anderen bevorzugt sein.

Nach Pumpe Infusion oder einer bestimmten Zeit nach dem ICV Bolusinjektion (wir verwenden routinemäßig vier Wochen), ist es wichtig, die Wirksamkeit der ASOs testen. Wir empfehlen, die verschiedenen Regionen des Gehirns und des Rückenmarks zu Ebenen / Isoformen des Zielgens zu messen, sowohl auf mRNA-Ebene mittels quantitativer real-time PCR sowie der Protein-Ebene entweder mit Western Blot oder ELISA (Abbildung 4 Beispiel für eine veröffentlichte ). Dies wird Ihnen helfen zu bestimmen ASO Wirksamkeit in den verschiedenen Regionen CNS. Wenn die Halbwertszeit des Proteins gezielt lang ist, raten wir länger warten nach ASO Infusion, um eine maximale Protein Knockdown oder Spleißen beurteilen. Es ist auch wichtig, Oligo Verteilung testen. Pump Infusionen in den Vertrieb über sowohl ipsi-und kontralateralen Hemisphäre führen, obwohl eine höhere Konzentration ASO wird häufig in Bereichen gesehen näher an der ventrikulären System 16. ICV Bolusinjektionen ergeben eine uniform Verteilung von Oligo durch die CNS 16, obwohl die Effekte können nicht so lange dauern. Wir weisen den Leser auf Southwell et al., Um einen direkten Vergleich der Pumpe gegenüber Bolus Oligo Verteilung 16 zu sehen. Wir empfehlen auch die Prüfung mehrerer Dosen sowie die Dauer der Wirkung der ASOs da jeder ASO etwas anders verhalten wird in vivo. ASOs haben in der Regel eine relativ lange Wirkungsdauer, mit Ziel-Knockdown oder Spleißen mehrmonatige Beitrag ASO Lieferung. Darüber hinaus werden einige ASOs besser funktionieren als andere, und einige Gen-Targets wird es leichter sein Knockdown als andere. Aus diesem Grund, wenn Screening die Lead-Kandidaten bestimmen Asos, empfehlen wir die Prüfung mindestens 3-5 ASOs in vivo mit n = 4-6 erwachsenen Mäusen pro ASO als ersten Durchgang. Wenn mit einem Medikament außer ASOs, wird es auch wichtig sein, um Pilot die ideale Wirkstoffkonzentration, Drogen Wirkdauer und ZNSVerteilung für die jeweilige Verbindung. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tabelle 1. Chirurgie Koordinaten. Die Koordinaten verwendet, um den rechten lateralen Ventrikel in beiden Mäusen und Ratten traf beim Einsetzen osmotischen Pumpen sowie die Durchführung einer intracerebroventricular (ICV) Bolus. Beide Koordinaten, für Pumpen und ICV Bolus, auf die richtige lateralen Ventrikel. Wir verwenden zwei verschiedene Sätze, weil das sind, was wir die meiste Erfahrung mit und wissen, bieten eine ausgezeichnete Verteilung der ASO. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Abbildung 1. Stereotaktische einrichten. (A) Die notwendige Ausrüstung für die stereotaktische Alzet Pumpe und Bolus Injektion Operationen. I) Glasperlen Sterilisierenr. ii) Digitalanzeige. iii) Stereotaktische Basis mit beweglichen Armen. iv) Temperature Controlled Heizkissen. v) Isofluran / Sauerstoff-System. vi) Isofluran Kammer. (B) Nahaufnahme von der Nase und Ohr Kegel Bars. (C) Zwei Anhänge erforderlich. Links: Spritze / Nadel Halter für ICV Bolusinjektionen. Rechts: Kanüle Treiber für osmotische Pumpe Implantation. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Abbildung 2. Alzet osmotische Pumpe Implantation. (A) Alzet osmotische Pumpe Optionen für Mäuse. . Pumpen 14 Tage (0,25 ul / h), 28 Tage Pumpen (0,25 ul / h), 42 Tage Pumpen (0,15 ul / hr) (B) Koordinaten für Pumpe Implantation von Bregma: -0.5 mm Posterior, -1.1 mm Lateral ( rechts) und -2.5 mm Ventral (Länge des Katheters). (C) Nach der Fahrt den Katheter durch dieSchädel und Verkleben der Kanüle ist Farbstoff durch den Katheter gespült, um die richtige Platzierung des Katheters in den lateralen Ventrikel zu beurteilen. (D) perfundierten Gehirn unmittelbar nach Farbstoff wie in (C) angewendet. Wenn Katheter erfolgreich Ventrikel platziert, wird der Farbstoff in der Maus ventrikulären verteilt werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Abbildung 3. Intracerebroventricular Bolus Injection. (A) Koordinaten für Bolus-Injektion von Bregma: +0,3 mm Anterior, -1.0 mm Lateral (rechts) und -3.0 mm Ventral (B) Nach der Fahrt die Nadel durch den Schädel -3.0 mm ventralen, Farbstoff durch die Spritze geschoben wird. auf die richtige Platzierung der Nadel in der späteren Ventrikel. (C) perfundierten Gehirn kurz nach Farbstoff wie in (B) verabreicht bewerten. Wenn Nadel wird erfolgreich in Ventrikels, der platziertFarbstoff wird in der Maus ventrikulären verteilt werden. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Abbildung 4. Antisense Oligonukleotide reduzieren Ratte SOD1 in vivo (Abbildung direkt von Smith et al. 7 genommen). (AD) Antisense Oligonukleotide SOD1 SOD oder SOD r146192 verschlüsselt wurden für 28 Tage in den rechten lateralen Ventrikel von normalen Ratten bei 100 ug / Tag infundiert. (A) Endogene SOD1-mRNA-Spiegel von Gehirn und Rückenmark durch qRT-PCR gemessen. ( B) SOD1 und a-Tubulin-Protein-Spiegel nach Infusion ASO. (C und D) Proteinspiegel für Tubulin und SOD1 quantifiziert verschiedenen Regionen des Gehirns nach der Infusion. (E) ASOs gegen Presenilin 1 oder GSK-3-beta; Wurden für 2 Wochen in den rechten lateralen Ventrikel von transgenen Mäusen und mRNA-Spiegel in der rechten frontalen / temporalen Kortex beurteilt infundiert. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von der American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Abbildung 5. Laufen Horizontal Matratzennaht. 5-0 Nylon Faden gesponnen wird in und aus der Haut, beginnend vorderen und hinteren arbeiten, konzentriert sich mehr über die Kanüle. Einmal mit dem hintersten Punkt erreicht ist, wird der Faden dann zurück gebracht und Gewinde über die Kanüle noch einmal. Dies gewährleistet die einwandfreie Wundverschluss und verhindert, dass die Kanüle / Schlauch von der Arbeit durch die Haut.

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Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Aufrufe.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.

Serie: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Eine computergesteuerte Testbatterie Pharmakodynamische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem cholinerge Medikamente in der frühen Phase Medikamentenentwicklung zu studieren

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...