Waschen Sie zunächst die kultivierten iPS-Zellen mit PBS oder DPBS von Dulbecco. Und fügen Sie einen Milliliter proteolytische und kollagennolytische Mischung hinzu. Inkubieren Sie die Schale zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen abzulösen.
Als nächstes fügen Sie 1,5 Milliliter vorgewärmtes iPSC-Nährmedium hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Trennen Sie die Zellen von der Zellkulturschale, indem Sie sieben- bis 10-mal auf und ab pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Pelletieren Sie die Zellen bei 200xg für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern iPSC-Nährmedium, das mit 50 Mikromolaren Y27632 ergänzt wird.
Verwenden Sie nun 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zu zählen. Stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf 9.000 Zellen pro 150 Mikroliter ein, indem Sie ein iPSC-Kulturmedium verwenden, das mit 50 Mikromolaren Y27632 ergänzt wird. Um Embryoidkörper oder EBs zu erzeugen, schütteln Sie das Zellsuspensionsröhrchen, um eine Zellsedimentation zu verhindern, bevor Sie 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedriger Befestigung aussäen.
Kultur der EBs in einer humifizierten Atmosphäre für 48 Stunden. Am Ende der Inkubation werden 100 Mikroliter Medium pro Vertiefung entnommen. Und fügen Sie 150 Mikroliter vorgewärmtes frisches Medium ohne Y27632 hinzu.
Erstellen Sie ein Vier-mal-Vier-Grübchen-Raster auf dem Parafilm, indem Sie das Parafilm-Raster mit der papierumhüllten Seite nach oben auf das 0,2-Milliliter-Röhrchengestell legen. Drücken Sie vorsichtig mit einem behandschuhten Finger gegen jedes Rack-Loch, um die EBs in die Basalmembranmatrix einzubetten. Entfernen Sie dann das Papier und schneiden Sie das Grübchengitter mit einer Schere aus dem Parafilmquadrat aus, um es so zu verkleinern, dass es in eine 60-Milliliter-Zellkulturschale passt.
Legen Sie den Noppen-Parafilm wieder auf das 0,2-Milliliter-Röhrchengestell, um eine Grundlage für die Tröpfchenerzeugung der Basalmembranmatrix zu schaffen. Übertragen Sie die EBs nacheinander vorsichtig mit einer Pipette mit einer abgeschnittenen 200-Mikroliter-Pipettenspitze aus der Vertiefung der Kulturschale in die Parafilm-Grübchen. Nachdem Sie 16 EBs in das Gitter verschoben haben, nehmen Sie eine neue 200-Mikroliter-Pipettenspitze und entfernen Sie das restliche Medium aus den Grübchen.
Pipettieren Sie nun einen Tropfen Basalmembranmatrix auf jedes Grübchen, das ein EB enthält. Nehmen Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze und bewegen Sie die EBs schnell in die Mitte jedes Tröpfchens, ohne die Tröpfchenränder zu stören. Legen Sie den Noppen-Parafilm mit den Matrixtropfen der Basalmembran in eine 60-Millimeter-Zellkulturschale. Und 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit die Matrix polymerisieren kann.
Um die in der Matrix eingebetteten EBs vom Parafilm zu lösen, geben Sie fünf Milliliter Differenzierungsmedium ohne Vitamin A in die Schale. Und drehen Sie das Parafilmquadrat mit einer Pinzette auf den Kopf, so dass die Seite mit den EBs zum Boden der Schüssel zeigt. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um die Matrixtropfen der Basalmembran, die die EBs enthalten, vom Parafilm zu lösen.
Wenn einige von ihnen noch angebracht sind, nehmen Sie mit einer Pinzette eine Kante des Parafilm-Quadrats und rollen Sie sie mehrmals schnell in Richtung Mitte der Schüssel auf. Anschließend kultivieren Sie die zerebralen Organoide auf einem Orbitalshaker bei 55 U/min in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft bei 37 Grad Celsius. Bewahren Sie die Organoide in DM ohne Vitamin A mit mittleren Änderungen jeden zweiten Tag auf.
Es wird ein Hellfeldbild eines 32 Tage nach der Aussaat befindlichen humanen Hirnorganoids mit ventrikelartigen Strukturen an der Peripherie und einer kompakten, gesunden Morphologie gezeigt.
