Die Autoren möchten sich bei Eva Hadzimova, Pierre Mattar und Christopher Kovach für ihre ersten Arbeit danken in Gründung in utero Elektroporation Technologie in der CS-Labor. Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institute of Health Research (CIHR) zu gewähren (MOP 44094) und CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging-Team Grant (00933-000) zur CS und Alberta Kinderkrankenhaus Research Foundation Grant DMK finanziert. RD von einem CIHR Kanada Hoffnung Stipendium unterstützt wurde, ist RC durch einen FFB Studentship unterstützt und LML wurde von einem CIHR Training Grant in der Genetik und Entwicklung des Kindes unterstützt.

1. Set-up <ol><li> Set-up OP-Bereich, wie in Abb. gezeigt. 1A, A &#39;. Die wichtigsten Komponenten des Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor, Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter, Leica steromicroscope, Glasfaser-Beleuchtung, ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden, Heizkissen und einem Verdampfer für Isofluran Narkose. </li><li> Reinigen Sie alle Werkzeuge mit einem Bransonic Ultraschallreiniger mit Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente. Sterilisieren Instrumente durch Autoklavieren. Sterilisiert Werkzeuge werden dann in Germex gehalten. </li><li> Bereiten Sie Spritzen mit warmen steriler Kochsalzlösung und sterile Ringer-Laktat-Lösung. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Legen Tier in einem kleinen (12cm x 20cm) Betäubung Kammer. Mit einem Verdampfer, liefern 5% Isofluran Anästhesie und Sauerstoff bei 1l/min (Abb. 1A, A &#39;). Bemerkenswert ist, ist es wichtig, Isofluran Auspuff sammeln mit einem Spülsystem. </li><li> Entfernen Tier aus der Kammer beim Atmen tief und regelmäßig wird. Toe Quetsch-und Lidschlag-Reflex-Tests werden verwendet, um Vollnarkose zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie schwanger Maus auf dem Rücken auf einem Heizkissen (37 ° C). Das Heizkissen ist zunächst durch Abreiben mit 70% Ethanol sterilisiert und dann mit einer sterilisierten, fusselfreien Gaze abgedeckt. Verwenden Sie eine Atemmaske und Maske Gerät zu liefern Isofluran (2,25%) während der Operation. </li><li> Inject Buprenorphin (0.1mg/kg Körpergewicht) subkutan unter die Haut am Nacken. </li><li> Monitor Tier während der Operation für tiefe und regelmäßige Atmung. Das Tier sollte nicht schnappen, atmen flach und schnell. Flache, schnelle Atmung kann ein Anzeichen einer flachen Narkose werden, und der Durchfluss von Isofluran sollte erhöht werden. Wenn das Tier beginnt zu keuchen, reduzieren Sie die Strömung von Isofluran. Im Falle eines Atemstillstands, schalten Isofluran aus und erhöhen Zustrom von Sauerstoff bis Tier erholt. Starten Sie Isofluran bei einer geringeren Konzentration. </li></ol> 3. Tierische Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Band Vorderbeine des Tieres auf die Heizkissen und prüfen Sie erneut für einen Widerruf Reaktion durch Einklemmen des Rückfußes mit einer stumpfen Zange. </li><li> Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen, verbreitet eine dicke Schicht von Enthaarungscreme (dh Nair) auf den Bauch. In festen Strichen, sicherzustellen, dass die Unterwolle komplett beschichtet ist. Lassen Sie bei einem mittleren von drei Minuten, Kontrolle zeitweise mit einem sterilen Wattestäbchen für die Haarentfernung. Wet eine sterile Gaze mit sterilem Wasser und wischen Sie den Bauch, bis alle Spuren verschwunden sind. Wiederholen Sie mit Chlorhexidin (dh Stanhexidine) Haut sauberer und Wasser. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze. </li><li> Sterilisieren Inzisionsstelle mit einem Chlorhexidin (dh Stanhexidine) um mehr sterilem Wasser gefolgt. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70% Ethanol und einem frischen, sterilisierten Wattestäbchen. </li><li> Legen Sie eine sterile Gaze über den Bauch mit einem Schlitz in der Mitte, durch die die Uterushörner während der Operation gezogen werden. </li></ol> 4. Inzision und Freilegung der Uterushörner <ol><li> Zur Freilegung der Uterushörner, suchen Sie zunächst der Linea alba, wie die schwache Linie unter der Haut an der Mittellinie. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Haut von der Bauchwand und schneiden Sie ein kleines, gerade Schnitt aus der Mitte des Bauches nach unten mit der Haut Schere (ca. 1 cm in der Länge). </li><li> Mit einer gebogenen Pinzette und Schere, wiederholen Sie den Vorgang mit dem Bauchfell. </li><li> Legen Sie steriler Gaze mit einer kleinen vertikalen Schlitz über Schnitt und dämpfen mit erwärmtem steriler Kochsalzlösung. </li><li> Slide Pinzette in den Einschnitt und suchen Sie die Gebärmutter. Halten offenen Einschnitt mit einer Pinzette beim Entfernen der Gebärmutter Hörner. </li><li> Vorsichtig greifen die Gebärmutter zwischen dem ersten und zweiten sichtbaren Embryonen und ziehen Sie die Embryonen auf die Gaze. Entfernen Sie beide Seiten des Uterushörner, indem auf die sterile Gaze und zählen die Anzahl der Embryonen ist auch jede Resorptionen oder &quot;ungesund&quot; (z. B. kleinere Körpergröße) Embryonen. Wet die Uterushörner mit Kochsalzlösung und vorsichtig wieder die Hälfte der Gebärmutter in den Bauch. </li></ol> 5. Die Injektion von DNA in Ventrikel <ol><li> Chirurgische Nadeln sind mit einem Sutter Flaming Micropipette Puller mit Borosilikat-Mikropipetten mit Kapillaren vorbereitet (Programm: Wärme = 750, Pull = 30, Vel = 90, Time = 150). Mit einem sterilen Skalpell, ist die Nadelspitze sanft aus in einem 45 Grad Winkel rasiert. </li><li> So laden Sie die Nadel, sind Pasteurpipetten zu einem schmalen Durchmesser unter einer Flamme gezogen. Ein Mundstück ist es, die Be-Pipette befestigt zu erarbeiten ~ 10 ul 3mg/ml Endotoxin-freie DNA mit 0,01% Methyl-grün gemischt (Anmerkung: Methyl-grünen Farbstoff ermöglicht DNA-Injektionen zu visualisieren). Der gefüllte Nadel wird dann auf einem Mikromanipulator Stativ montiert und an den FemtoJet Injektor. </li><li> Beginnend mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke, Pinzetten kreisförmigenwerden verwendet, um sanft wiederum der Embryo innerhalb der Dezidua, so dass es positioniert ist &quot;face-forward&quot;, so dass Injektionen in einem rostral kaudal auftreten. Eine Faseroptik-Lichtquelle für die Beleuchtung wird verwendet, um zu visualisieren der Mittellinie des embryonalen Gehirns, die durch die großen lateralen Ventrikel in rostralen Regionen (Abb. 1B, B &#39;) flankiert wird. </li><li> Der Embryo wird in der Position mit kreisenden Zange gehalten. Die Nadel ist über der Gebärmutter so positioniert, dass der Winkel für die Einreise in das Gehirn ist etwa 45 Grad. Mit dem Mikromanipulator und eine schnelle und stetige Bewegung wird die Nadelspitze durch die Gebärmutterwand und in den lateralen Ventrikel des Embryos eingesetzt. Die Injektionen werden in Richtung der Seitenventrikel, 3. Ventrikel oder subretinalen Raum zum Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut, bzw. Ziel gerichtet. Beachten Sie, dass das embryonale Gehirn Bläschen offen sind, in einem frühen embryonalen Stadium, so dass DNA injiziert in die Seitenventrikel wird in der 3. Ventrikel fließen. </li><li> Drücken Sie das Fußpedal zur Endotoxin-freie DNA (1-3 mL) mit einer Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor injizieren. Eine erfolgreiche Injektion ist einfach visualisiert durch die Verbreitung der Methyl-grünen Farbstoff in den embryonalen Ventrikel im Gehirn. Die Nadel wird dann langsam durch Zurückziehen bis zum Bruch zu vermeiden entfernt. </li></ol> 6. Elektroporation <ol><li> Die injizierten Embryonen (noch innerhalb der Gebärmutter) ist auf dem steriler Gaze darüber liegenden Bauch der Mutter und nass gründlich mit warmen Kochsalzlösung gelegt. Bitte beachten Sie ** Der Zusatz von Kochsalz auf die Membranfläche ist wesentlich für eine effiziente Durchgang eines elektrischen Stromes ermöglichen. </li><li> GenePaddle Elektroden werden verwendet, um die Gebärmutter nach der Injektion von DNA Griff. Fünf quadratische elektrische Impulse von 40-50V und 50 ms sind bei einer Rate von einem Impuls pro Sekunde mit einer ECM8300 BTX Elektroporation System (Abb. 1C, C &#39;) geliefert. </li><li> Decken Sie die injizierten / elektroporiert Embryo mit Schutzfolie nass Gaze und fahren bis zur nächsten Embryo. </li><li> Nach Abschluss der Injektion / Elektroporation von allen gewünschten Embryonen, spitzen Gegenstand auf das Uterushörner zurück in den Bauchraum (Abb. 1D). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das andere Uterushorn und beginnen wieder mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke. </li></ol> 7. Suture und Heften <ol><li> Sobald alle Embryonen sind zurück in der Gebärmutter, in die Bauchhöhle ~ 2-3 ml warme Kochsalzlösung hinzuzufügen. </li><li> Zum Schließen der Wunde, durch das Entfernen der Gaze auf den Bauch und die Identifizierung der Seiten des Peritoneum zu beginnen. Begin Naht des Bauchfells mit schwarzem geflochtenen Seidenschnur. Es wird nicht empfohlen, resorbierbares Nahtmaterial für dieses Verfahren verwenden, da es in der Regel schwächer und kann zu postoperativen Blutungen und Infektionen führen. Verankern Sie die Leitung auf dem Bauchfell am nächsten zum Brustbein und fahren Sie mit Stich vom Anker. Sicherstellen, dass alle Nähte dicht sind, und dass keine zugrunde liegende Organe oder der Haut wurde versehentlich in das Peritoneum angenäht. Clip der restlichen Naht und entsorgen. </li><li> Pull Haut geschlossen über die Naht mit einer Pinzette. Mit 9 mm Reflex ™ Hautverschluss Klammern, Clip die Haut über der Wunde, dabei nicht zu heften Sie die Naht unterhalb oder auf der Haut zu eng zu ziehen. Die bevorzugte Methode ist, um die Haut zu halten und vom Körper weg mit einer Pinzette, und kommen in einem 90 Grad Winkel mit der Klammer-Tool. Fahren Sie bis Wunde geschlossen ist (etwa drei Heftklammern). Sobald Sie fertig sind, sicherzustellen, Heftklammern dicht sind durch leichtes Drücken mit der Naht-Werkzeug (Abb. 1D). </li></ol> 8. Post-OP-Pflege <ol><li> Zur Überwachung Aufwachraum, schalten weiblichen auf ihren Bauch, und schalten Sie Isofluran. Keeping das Tier das Gesicht in der Atemschutzgeräte, wiederum Sauerstoff bis zu 3% auf aus der Narkose zu helfen. Das Tier sollte auf einem sauberen, trockenen Gaze auf dem Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern platziert werden. </li><li> Während das Tier groggy, spritzen 2 ml Ringer-Lösung subkutan unter den Hals des Tieres Haut. </li><li> Halten Sie das Tier unter Sauerstoffzufuhr für einige Minuten und Erwärmung Gazekompressen um wecken das Tier. Kurze Spurts der Bewegung des Tieres zu beachten, da es zu einer normalen Atmung zurückkehrt. Beachten Sie für einige Minuten, bis Tier scheint bewusst und wach. </li><li> Spray des Weibchens Bauch mit Gentamicin-Spray und wickeln Sie das Tier in eine sterile Gaze. </li><li> Übertragen Sie die Tiere in einen sterilen Käfig mit autoklaviert Betten und Karton Gehäuse. </li><li> Wasserflaschen sollten gründlich gereinigt werden, sterilisiert und befüllt mit sterilem Wasser. Zu 500 ml Wasser hinzufügen, 2 ml Sulfamethazin Antibiotika (25% Aktien). </li><li> Verwalten 0,05 mg / kg subkutan Buprenorphin am Morgen nach der Operation. </li><li> Überwachen Sie den weiblichen eng für die ersten 24 Stunden nach der Operation. Wenn die Tiere länger als 24 Stunden aufbewahrt werden, sind Frauen, neue ster verschobenile Käfigen am Tag 2. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Neocortex Der Neocortex ist die Region des ZNS, die für die visuelle und sensomotorische Verarbeitung und höheren kognitiven Funktionen ist. Es ist der glutamatergen Projektion Neuronen und GABAergen Interneuronen, die aus der dorsalen und ventralen Telencephalon abgeleitet werden, bzw. besteht. Um die Rolle verschiedener Gene in neokortikalen Entwicklung, verwenden wir in utero Elektroporation entweder misexpress oder Sperrung der Ausdruck (dh durch die Verwendung von shRNA Konstrukte) verschiedener Gene in der dorsalen oder ventralen Telencephalon 1,3,4. Um misexpress Gene in der embryonalen Telencephalon, verwenden wir eine bicistronische Expressionsvektor (pCIG2), mit einer CMV-Promotor-Enhancer βactin und eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES)-Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP; in pCIG2) Kassette, so dass transfizierten Zellen, die durch Epifluoreszenz (Abb. 2A-C) nachgewiesen werden. Wir nutzten diese Technik, um die Expression-Konstrukten in das Telencephalon Einführung von E11.5 bis E15.5 (angezeigten Daten an E12.5;. Abb. 2). Dadurch, dass Embryonen zu entwickeln mehrere Tage nach der Elektroporation, sind wir in der Lage, die Differenzierung und Migration von GFP-markierten Vorläufern zu verfolgen. Als Differenzierung erfolgt, 3 Tage nach der Elektroporation GFP +-Zellen differenzieren und wandern aus der ventrikulären Zone (vz), subventrikulären Zone (SVZ) und Zwischenzone (iz) und in der kortikalen Platte (cp;. Abb. 2C). , Basalen Vorläuferzellen (dh Tbr2; Wenn Gehirne bei E12.5 elektroporiert nach 24 Stunden analysiert werden, können wir frühere Ereignisse in Vorläuferzellen der Reifung und der neuronalen Migration durch Co-Kennzeichnung mit Markern der apikale Vorläuferzellen (. Abb. 2A dh Pax6) zu überwachen; . Abb. 2B) und postmitotischen neokortikalen Neuronen (dh Tbr1;. Abb. 2C). Diencephalon Der Hypothalamus liegt an der ventralen Basis des ZNS und fungiert als Gateway zwischen den endokrinen und vegetativen Nervensystems. Bei der Entwicklung der mehrere Kerne, aus denen sich die reifen Hypothalamus von einer gemeinsamen Stammform Zone unterscheiden, die Linien der ventral-äußerste Region des embryonalen Zwischenhirns. Derzeit sind die molekularen Mechanismen, die Vorläuferzellen der Zellproliferation, der neuronalen Differenzierung und die Bildung von Hypothalamus Kerne regulieren wenig verstanden. Wir haben in utero Elektroporation Reportergenexpression der embryonalen Zwischenhirns Ziel durch die Injektion von DNA in der 3. Ventrikel des E12 embryos.We folgte dann die Verteilung der GFP bei der Differenzierung von Neuronen bei E14. Mit dieser Methodik haben wir erfolgreich die GFP-Expression auf den Thalamus, pre-Thalamus und Hypothalamus (Abb. 3A) ausgerichtet. Die Analyse der koronalen Abschnitte zeigt, dass es uns gelungen, die GFP-Expression zu Vorläuferzellen gezielt diese Linie der ventrikulären Zone des 3. Ventrikels und Neuronen, die aus dem Erdmantel Zone migrieren, um Kerne zu bilden (Abb. 3B) Retina Die Netzhaut ist die neuronale Schicht des Auges, verantwortlich für die Umwandlung von Licht Photonen in elektrische Impulse an das Gehirn weitergeleitet. Es entwickelt sich als Ausstülpung des embryonalen Zwischenhirns, und damit wird aus dem Neuralrohr abgeleitet. Das neuronale Netzhaut entwickelt sich aus einer apikalen Vorläuferzellen Fach, dass neben den subretinalen Raum, einen Hohlraum, der das Auge trennt den Kopf Mesenchym liegt. Targeting DNA-Konstrukte zu retinalen Vorläuferzellen erfordert daher, dass Injektionen in ein kleines Zielgebiet vorgenommen werden. Mit Mikromanipulatoren, haben wir es geschafft, erfolgreich Ziel dieser kleinen Fläche in Embryonen von E13.5 bis E15.5 (gezeigt wird E15.5 electroporations der PCIC mit mCherry Reporter; Abb. 4).. Wenn elektroporiert retinae 24 Stunden nach der Transfektion untersucht werden, beobachten wir, dass die meisten mCherry +-Zellen sind in der äußeren Schicht Neuroblasten (onbl), wo Teilung Vorläuferzellen befinden, und nicht in den retinalen Ganglienzellen (gcl; Einschub) befindet, wo postmitotischen Zellen zu lokalisieren. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Einführung in die in utero Elektroporation Set-up und Methodik. (A) Die wichtigsten Komponenten des OP-Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor (1), Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter (2), Leica steromicroscope (3), faseroptische Beleuchtungssysteme System (4), ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden (5) und Heizkissen (6). (A &#39;) Das Tier ist betäubt mit einem Verdampfer für Isofluran Narkose. (B, B &#39;) Kurz nach der Narkose sind die Uterushörner ausgesetzt und DNA mit schnellen Grün gemischt wird in den embryonalen Gehirn Bläschen injiziert. Eine erfolgreiche Injektion wird visualisiert durch die Verfolgung der schnellen grünen Farbstoff (B &#39;). (C, C &#39;) Nach der DNA erfolgreich injiziert wird, sind die Paddle-Elektroden auf beiden Seiten der Gebärmutter, Positi platziertenantrieb oniersystem der Embryo, so dass die DNA wird nach dem positiven Pol in die Region des Gehirns der Wahl gezogen werden. (D, D &#39;) Nachdem alle gewünschten Embryonen injiziert werden, die Gebärmutter ist zurück in den Bauchraum (D) gedrückt wird, wird das Bauchfell vernäht, und die Haut wird geheftet (D&#39;). Die schwangere Frau ist dann erlaubt sich zu erholen und die Elektroporation Welpen sind an der gewünschten Zeitpunkten gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Repräsentatives Beispiel für dorsal telencephalic Elektroporation. (AC): Mikroskopische Aufnahme eines koronalen Schnitt durch eine E13.5 dorsalen Telencephalon bei E12.5 mit pCIG2 elektroporiert. Elektroporiertem GFP +-Zellen sind bekannt für ihre Expression von Markern der apikalen Vorfahren analysiert (Pax6 +, rot, A), basale Vorläuferzellen (Tbr2 +, rot, B) und postmitotischen Neuronen (Tbr1 +, rot, C). cp, kortikalen Platte; SVZ, Subventrikularzone, vz; ventrikuläre Zone. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Repräsentatives Beispiel für Zwischenhirn Elektroporation. (A) A ventrale Ansicht eines E14 Gehirns, die bei E12 wurde mit pCIG2 elektroporiert. GFP Epifluoreszenz sichtbar in den Thalamus, demonstrieren vor Thalamus und Hypothalamus, die Ausbreitung der mikroinjiziert pCIG2 Plasmid während der 3 rd Ventrikels. (B) Mikroskopische Aufnahme Frontalschnitt durch Elektroporation Gehirn, welche die Migration von GFP +-Zellen aus der ventrikulären Zone und in den Mantel-Zone, wo hypothalamischen Kerne bilden. 3V, dritten Ventrikel; T, Thalamus, Hy, Hypothalamus, mz, Mantel-Zone; Tel, Telencephalon; PreT, prethalamus; vz, ventrikuläre Zone. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für Netzhaut-Elektroporation. Frontalschnitt durch eine E16.5 Auge mit PCIC bei E15.5 elektroporiert zeigt die Akkumulation von mCherry + Zellen in der äußeren Schicht Neuroblasten und nicht in Brn3b + retinalen Ganglienzellen in den Ganglienzellen. Der Einschub ist ein höherer Vergrößerung Bild von dem eingerahmten Bereich. gcl, retinalen Ganglienzellen Schicht; le, Linse; onbl, äußere Schicht Neuroblasten; re, Netzhaut.

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In utero Elektroporation kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Entwicklungs-Prozesse analysiert werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Reportergen wie GFP, mCherry oder alkalische Phosphatase verwendet werden, um Abstammung Tracing und neuronalen Migration Experimente durchzuführen. Alternativ kann die Rekombinase Cre transient exprimiert werden, um selektiv beseitigen eine floxed Allel in einem räumlich-und / oder zeitlich gesteuert. Darüber hinaus können shRNA oder dominant negative Konstruk...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kategorie </th></tr><tr><td> Feine Schere </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Iris Schere, gebogen </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicate Nadelhalter </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Ring Pinzette, 9mm </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Eye dressing Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 7 DMX Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 DMX Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Tissue ForceP-Adson </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Reflex Clip-Applikator </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500343 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Perforierte Löffel, 15 mm Durchmesser </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Silk schwarz Geflochtener </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Reflex Hautverschluss Stainless Steel Wound Clips </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500346 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave Elektroporationssystem </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Pinzette w / Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plattenelektrode </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Pinzette w / Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plattenelektrode </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Fußschalter für Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (Sonstiges) </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Bransonic Ultraschallreiniger Modell 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952 bis 118 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Sutter P97 Mikropipette Puller </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Mikropipetten - Borosilikatglas mit Filament OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, Länge 10 cm </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78 bis 10 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> 3-Achsen-Manipulator Coarse </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Magnetic Haltevorrichtung für Mikromanipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> M1 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Grundplatte aus Stahl für Mikromanipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5052 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipette Halter </td><td> World PrNTSCHEIDUNG Instruments </td><td> MPH3 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipette Griff </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5444 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Vaporizer für Isofluran Narkose </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODELL 100-F </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Gentamicin 40mg/ml in 0,2 g Methylenblau Antibiotikum Spray nach dem Vernähen </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Germex zur Sterilisation chirurgischer Instrumente </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> BNP Augensalbe </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distributed by Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> im Handel erhältlich </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v Haut Reiniger </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Buprenorphin (Temgesic) analgetische </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; Sulfamethazin Antibiotikum </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Lösung </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% Natriumchlorid </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Inhalationsnarkose - Isofluran USP </td><td> Pharmaceutical Partners of Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

Die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren ist der Grundstein der modernen experimentellen Embryologie, was zur Aufklärung von mehreren Entwicklungspfaden. Verschiedene leistungsfähige und gut etablierten transgenen Technologien zur Verfügung, um Genexpression in der Maus zu manipulieren, so dass für die Erzeugung sowohl Verlust-und Gain-of-function-Modelle. Allerdings ist die Erzeugung von Maus Transgenik sowohl kosten-und zeitaufwendig. Alternative Methoden der Gen-Manipulation wurden daher häufig gesucht. In utero Elektroporation eine Methode der Gentransfer in die Live-Maus-Embryonen 1,2, dass es uns gelungen, 3,4 angepasst ist. Er basiert weitgehend auf den Erfolg der in ovo Elektroporation Technologien, die häufig in Küken 5 zum Einsatz kommen. Kurz gesagt, ist die DNA in die offenen Kammern des sich entwickelnden Gehirns und die Anwendung eines elektrischen Stromes bewirkt die Bildung von transienten Poren in Zellmembranen injiziert, so dass für die Aufnahme von DNA in die Zelle. In unseren Händen, können Embryonen effizient so früh wie embryonale Tag (E) 11,5 elektroporiert werden, während die Ausrichtung der jüngeren Embryonen eine Ultraschall-geführte Mikroinjektion Protokoll, wie zuvor 6 beschrieben erfordern würde. Umgekehrt ist E15.5 dem neuesten Stand wir leicht elektroporieren kann, aufgrund der Beginn der parietalen und frontalen Knochen Differenzierung, die Mikroinjektion behindert in das Gehirn. Im Gegensatz dazu ist die Netzhaut zugänglich über das Ende der Embryogenese. Embryonen können zu jedem Zeitpunkt während der embryonalen oder frühen postnatalen Phase gesammelt werden. Die Injektion eines Reporter-Konstrukt ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen. Bis heute hat in utero Elektroporation wurde am häufigsten für die Analyse der Neokortex Entwicklung 1,2,3,4 verwendet. Neuere Studien haben die embryonalen Netzhaut 7,8,9 und Thalamus 10,11,12 ausgerichtet. Hier präsentieren wir eine in utero Elektroporation Protokoll, das leicht angepasst werden kann, um verschiedene Bereiche des embryonalen ZNS Ziel geändert. Wir beweisen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir die embryonalen Telencephalon, Diencephalon und Netzhaut Ziel. Repräsentative Ergebnisse vorgestellt werden, erste, welche die Anwendung dieser Technik, um DNA-Expressionskonstrukte in den Seitenventrikel eingeführt, so dass wir Vorläuferzellen Reifung, Differenzierung und Migration in der embryonalen Telencephalon überwachen. Wir zeigen auch, dass diese Technik verwendet werden, um DNA, die Zwischenhirn Gebiete rund um den 3. Ventrikel Ziel sein, so dass die Flugrouten der differenzierenden Neuronen in Zwischenhirn Kerne überwacht werden. Schließlich zeigen wir, dass die Verwendung von Mikromanipulatoren uns genau vorstellen DNA-Konstrukte in kleine Zielgebiete, einschließlich der subretinalen Raum ermöglicht, so dass wir den Einfluss der Manipulation der Genexpression auf der Netzhaut Entwicklung zu analysieren.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K Aufrufe.  University of Calgary. In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Serie: Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Forschung

Neurowissenschaften

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS<i&gt; über</i&gt; Die Arteria carotis interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...