This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Tier Arbeit wurde von der Universität Newcastle Ethics Review Board zugelassen und genehmigt. Alle Tierverfahren wurden über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, um den Richtlinien von der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments durchgeführt entspricht. 1. EdU Verwaltung <ol><li> Auflösen EdU in steriler Kochsalzlösung (0,9% w / v) bei einer Endkonzentration von 12,5 mg / ml. <ol><li> Die Lösung wird auf 40 ° C und Wirbel um vollständig zu lösen. Bewahren Sie genug EdU / Saline bei 4 ° C alle Mäuse in der Studie zu injizieren, so dass für 6 tägliche Injektionen. Hinweis: In der Regel mehr als 6 Mäuse für jede Versuchsgruppe erforderlich sind. Allerdings Leistungsberechnungen sollten für unabhängige Studien durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Wiegen Sie einzelne Mäuse. Berechnen Sie das erforderliche Volumen 100 ug / g EdU / Salzlösung zu jeder Maus (8 ul Lager EdU Lösung pro g) zu verabreichen. </li><li> Zeichnen Sie die entsprechenden volume von EdU / Kochsalzlösung in Insulin-Spritze mit einer 25 G-Nadel. </li><li> Führen Sie intraperitoneale (ip) Injektionen beim Umgang mit Mäusen mit zugelassenen Home Office-Techniken. <ol><li> Legen Sie eine Maus auf den Käfig Deckel. Ziehen Sie vorsichtig an der Basis des Schwanzes zurück und fest mit der Maus durch das Genick fassen. </li><li> Expose den Bauch für die Injektion mit der Maus mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe der Basis des Kopfes halten und kippt den Kopf des Tieres nach hinten auf den Boden. </li><li> Wischen Sie den Bauch mit 70% Alkohollösung. Suchen Sie die Mittellinie des Tieres und unteren rechten Quadranten. Injizieren Sie die EDU / Salzlösung in das Tier in den unteren rechten Quadranten. </li><li> Injizieren von Mäusen mit EdU / Kochsalzlösung und die Tageszeit aufzuzeichnen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.4 an der gleichen Tageszeit, für 6 aufeinander folgenden Tagen. Hinweis: Da ein EdU Negativkontrolle erforderlich ist, die Gating für Durchflusszytometrie-Analyse zu setzen, injizieren ein zusätzliches Alter, Geschlecht und experimentell entsprechened Maus mit einem äquivalenten Volumen von Kochsalzlösung ohne EdU. Dadurch wird die erforderliche Kontrolle (keine EdU Kontrolle). Diese Kontrolle sollte einbezogen werden für jede Studie für Variationen in Chargen von Reagenzien zu ermöglichen und cytometer einzurichten. </li></ol> 2. Ernten Herzen <ol><li> Bei 24 Stunden nach dem 6. EdU Injektion, opfere Mäuse Zervikaldislokation (oder eine alternative Liste 1 Home Office genehmigt Methode). </li><li> Legen geopfert Tier in Rückenlage und machen Hautschnitt aus der Mitte des Bauches auf die Membran mit einer chirurgischen Schere. </li><li> Schneiden Sie das Zwerchfell, und Halten des Brustbeins weg von der Körperhöhle, schneiden bilateral das Herz aussetzen. </li><li> Heben Sie das Herz leicht und schneiden Sie die großen Blutgefäße des Ausflusstraktes das Herz aus der Brusthöhle zu sezieren. </li><li> Unmittelbar jedes Herz platzieren zu einem einzelnen 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml PBS auf 4 ° C gekühlt. </li><li> Übertragen Herzen separate 10 cm Petrischalen, mit einem Skalpell jedes Herz in zwei Teile geschnitten in einer sagittalen Ausrichtung und waschen Sie das Herz, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken. Dann ersetzen Sie die PBS so viel Blut wie möglich zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Legen Sie beide Teile jedes Herz in demselben Individuum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Weiter zu Schritt 3 oder alternativ speichern Proben -80 ° C wie in den Schritten detailliert 2.9 und 2.10. </li><li> Unter Verwendung einer 25 G Nadel, stellen ein kleines Loch in dem Mikrozentrifugenröhrchen Deckel, den Deckel von der Öffnung auf die Ausdehnung von Gasen durch zu verhindern, wenn das Herz verarbeitet wird. </li><li> Beschriften Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen und in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff einzufrieren. </li></ol> 3. Nuclei Dissoziation und Cardiomyocyte Nuclei Labeling Hinweis: Diese Kerne Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Kennzeichnung von der Bergmann et al angepasst ist 11 Führen Sie dieses Verfahren auf allen injizierten Proben.mit EdU und injizierten Salzlösung (keine EdU Kontrolle) negative Kontrolle. Siehe Tabelle 1 für das Rezept von Lösungen zur Durchführung dieser Schritte erforderlich. <ol><li> Für jeden Herz analysiert werden, legen 36 ml 1% BSA / PBS-Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen, für 30 min inkubieren, um die Lösung zu verwerfen und dann an der Luft trocknen. Hinweis: Dieses Rohr in Schritt 3.6 verwendet wird. </li><li> Legen Sie einzelne gefrorenen Herzen auf eine 10-mm-Schale auf Eis und Hackfleisch mit einem Skalpell so dass das Herz während des Zerkleinerungs- Prozess auftauen. </li><li> Platzieren gehacktem Herzen in 15 ml of Cell Lysis Buffer in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und homogenisieren mit einer Sonde Homogenisator für 15 Sekunden bei 25.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> In weitere 15 ml Zell-Lysepuffer in die Zentrifugenröhrchen und in ein 40 ml Dounce mit einem großen Freiraum Stößel. Führen Sie 10 Schläge mit dem Stößel und filtriert über ein 100 um dann 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge für 10 min eint 700 × g bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren Kernpellet in 25 ml Saccharose-Gradienten-Lösung und die Schicht hergestellt, um die Zellkerne enthaltenden Lösung auf die Oberseite von 10 ml frischem Saccharosegradienten Lösung in dem Röhrchen Ultrazentrifuge in 3.1. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C einer Ausschwingzeit Rohr Rotor verwendet wird. </li><li> Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und die Kerne resuspendieren Pellet in 1300 &amp; mgr; l der Zellkerne Speicherpuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Etiketten PCM1. </li><li> Entfernen Sie 300 ul der Suspension auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 700 ul frischen Kerne Speicherpuffer. Beschriften Sie diese Röhre als ISO-Steuerung. </li><li> Hinzufügen anti-PCM1 bei einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem PCM1 und Kaninchen-IgG-Isotyp-Kontrollantikörper bei einer Konzentration von 8 &amp; mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem ISO Steuerung hinzuzufügen. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Nach incubation, Zentrifuge bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen, mit 1 ml frischem min bei 700 x g für 10 Kerne Speicherpuffer, resuspendieren und Zentrifuge wieder ersetzen. Überstand verwerfen und ersetzen mit 1 ml frischem Kerne Speicherpuffer. </li><li> 1 &amp; mgr; l F (ab &#39;) 2 Fragment Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) Antikörper (FITC oder äquivalente grün fluoreszierenden Farbstoff) zu einer Endkonzentration von 2 ug / ml zu erreichen. Anmerkung: Die Verwendung eines F (ab &#39;) 2-Fragment-Antikörper verringert das Potential für nicht-spezifische Markierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen und B-Zellen. </li><li> Wrap Rohre in Aluminiumfolie vor Licht zu schützen und für 1 Stunde bei 4 ° C inkubieren. </li></ol> 4. Nachweis von EdU Incorporation <ol><li> Dilute 10x konzentriert EdU Reaktionspuffer im Verhältnis 1:10 mit VE-Wasser. </li><li> Zentrifugieren Sie die PCM-1 und ISO-Steuerung markierten Kerne Suspensionen bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen und das Pellet-Kerne in 1 ml1% BSA / PBS-Lösung. Waschen Sie die Kerne Pellet zweimal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, den Überstand verwerfen und ersetzen mit 100 ul EdU Fixiermittel. </li><li> Wickeln Rohre in Aluminiumfolie vom Licht geschützt und bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 ml 1% BSA / PBS-Lösung, Zentrifugation bei 700 xg und inkubiere mit 1x Saponin basierenden Permeabilisierung Lösung bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Bereiten Sie 1x EdU Kennzeichnung Cocktail (Tabelle 2). Ein Minimum von 2 Reaktionen werden benötigt, die keine EdU Kontrolle aufzunehmen. </li><li> Hinzufügen 500 ul 1x EdU Markierungscocktail direkt bereits zu jeder Probe Kerne in 100 ul 1x Saponin basierenden Permeabilisierung enthaltenden Lösung und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Zentrifuge bei 700 xg und Resuspendieren in 1 ml 1% BSA / PBS und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. </li><li> Zentrifuge bei 700 xg, Überstand verwerfen und ersetzen mit 400 &amp; mgr; l DNA - Färbelösung (siehe Tabelle der Materialien). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Benennen des Reagens </td></tr><tr><td> 1. Zell - Lysepuffer </td></tr><tr><td> 0,32 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 2,0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradient - Lösung </td></tr><tr><td> 2,1 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 3. Nuclei Speicherpuffer (NSB) </td></tr><tr><td> 0,44 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM Spermin </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Nuclei Isolationspuffer Zutaten Rezept für alle verwendeten Puffer in Protokollabschnitt 3 (Nuclei Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Markierung).. 5. Analyse über Durchflusszytometrie Hinweis: Führen Sie Durchflusszytometrie auf isolierten Kernen wie zuvor beschrieben 7,11,15. <ol><li> Erstellen Sie zunächst eine Handlung beschreibt Forward Scatter (FSC) und Seitenstreuung (SSC) , um die Diskriminierung von Kernen aus Schutt (2A) zu ermöglichen. </li><li> Erstellen Sie ein Grundstück zu einzelnen Kerne aus Aggregaten (2B) unterscheiden durch Auftragen 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) Bereich (3-405 / 450/50 A) im Vergleich zu der Höhe (33-405 / 450 / 50-H). Stellen Sie sicher, that die 3-405 / 450/50-A-Signal auf der linearen Skala gesammelt wird, um die korrekte Bestimmung des DNA-Gehalts zu ermöglichen. </li><li> Erstellen Sie eine Handlung beschreibt, 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC und zeigt nur Ereignisse aus dem Singulett-Gate in 5.2 geschaffen, um PCM-1-Expression in den Singulett-Population zu beurteilen. </li><li> Führen Sie die Isotypkontrollreagenzien Probe um ein PCM-1 positive Gate (2C) zu etablieren. Führen Sie eine kleine Menge von PCM1 Probe markiert, um die PCM1 exprimierenden Population und Gating-Position zu überprüfen. </li><li> Erstellen Sie einen Plan beschreibt SSC-A vs 405/450/50-A (zu erkennen DAPI). In diesem Plot, nur Anzeige PCM1 exprimierenden Zellkerne Singulett, unter Verwendung der in 5.3 erstellt Tore. Verwenden Sie dieses Grundstück ein zusätzliches hierarchal Tor zu erzeugen , die nur 2N Kerne (2D) enthält. </li><li> Erstellen Sie ein Plot, der 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20 A beschreibt die Identifizierung von EdU Kennzeichnung des PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten Bevölkerung zu ermöglichen. Anzeige nur Kerne, die Singulett sind, P<html> CM1 + und 2N die obige Gating. </li><li> Führen Sie Herz Probe von keiner EdU Kontrolle , um den EdU positiven Gate (Abbildung 2E). Erstellen Sie die entsprechende Tor für EdU + Zellen. </li><li> Die Bilanz und zu quantifizieren, Singulett, PCM-1 exprimieren, 2N Kerne, die EdU eingebaut haben. </li><li> Berechnen Sie diese Bevölkerung als Prozentsatz des Gesamt Singulett, PCM1 + Kerne. Dies wird die Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation, während der 7 Tage EdU Pulsperiode, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten cardiomyocyte Kerne bereitzustellen. Hinweis: Da DAPI zur DNA-Bindung stöchiometrisch ist die Fluoreszenzintensität mit der Menge an DNA proportional ist. Ploidie bestimmen basierend auf der Intensität von 405/450/50 A - Signal, wie vorher 7 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die Ploidie in der gesamten Kardiomyozyten Bevölkerung zu bewerten Strategie die Handlung etabliert in 5.5 und einer Gating basierend auf DNA - Konzentration 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2:. Gating - Strategie Kardiomyozyten EdU Einbau und Ploidie zu quantifizieren (A) Nuclei aus Schutt diskriminiert basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC). (B) ein lineares Gate angelegt und der Singulett - Keimpopulation beruht auf DAPI Kennzeichnung identifiziert und die Höhe 405/450/50 vs Bereichssignal. (C) Fluorescent Gating erlaubt die Trennung von Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positiv) und nicht-Kardiomyozyten (PCM-1-negativ) Zellkerne von Herzgewebe. (D) Die Intensität des DAPI - Signal wird verwendet , um DNA - Konzentration zu bestimmen und dadurch Kerne Ploidie der PCM1 + Kardiomyozyten Bevölkerung. In Maus&gt; 80% der Kardiomyozyten Kerne sind diploiden (2n). (E) Fluorescent Gating ermöglicht die Trennung von 2N, Kardiomyozyten Kerne , die EDU (PCM + / EDU + = 0,9%) aus 2N eingebaut haben, Kardiomyozyten , die EdU nicht integriert haben (PCM + Edu-). Alle Schritte werden in dem Protokoll 5.0 beschrieben. Beispiel von MDX gezeigt -. / Y Mäuse auf dem C57 / BL10 Hintergrund <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Zur Quantifizierung genau Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration Tests müssen zwischen echten Kardiomyozyten Generation und unproduktiven DNA Teilung unterscheiden. Viele Studien weiterhin einfach diese unproduktiven Ereignisse ignorieren, Kardiomyozyten Proliferation Quantifizierung ausschließlich über die Expression von Cyclin kinesis und Zellzyklus-Marker. Um eine einzelne Methode Datum, das die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz ermöglicht, während für diese unproduktiven Ereignisse Steuerung bleibt allusive. Insbesondere bleibt es schwierig für Kardiomyozyten Polyploidisierung zu berücksichtigen , die 13 bis ~ 65% der Kardiomyozyten DNA - Replikation trägt auf. Daher sind in der genauen Quantifizierung von Kardiomyozyten Generation zu unterstützen wir ein Protokoll entwickelt, das die robuste Quantifizierung der Raten von neo Kardiomyozyten Kerne erlaubt, während die DNA-Replikation ohne die erhöhte Ploidie führt. Obwohl dieses Protokoll keine Diskriminierung zwischen neo-Kardiomyozyten Gattungention und Kardiomyozyten bi-Nukleation, kann sie schnell eingesetzt werden und genau die obere Grenze (Bilanzierung von Ploidie) von Kardiomyozyten Generation berechnen. Dieses Protokoll stellt daher ein Screening-Tool zu möglichen Veränderungen in den Raten von Kardiomyozyten Generation und Polyploidisierung in Krankheitsmodellen zu bewerten oder das Potenzial, die Effizienz von Therapeutika zu bewerten. Sobald Änderungen in der Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation identifiziert werden unter Verwendung dieses Protokolls können nachfolgenden Studien verwendet werden , um festzustellen , ob dies aufgrund von Änderungen in Kardiomyozyten Erzeugung von Kardiomyozyten Nukleation Nummer, wie zuvor beschrieben 2,13,17,18. Dazu gehört die Verwendung von histologischen Quantifizierung Kardiomyozyten Nukleation Dynamik während der Pulsperiode oder Analysen von Gewebeschnitten, die aus EdU gepulsten Tiere in EdU Einarbeitung in die einkernigen und mehrkernigen Kardiomyozyten Populationen zu vergleichen. Aufgrund der geringen Mengen an Kardiomyozyten Umsatz dieserProtokoll verwendet mehrere Injektionen von EdU über einen Zeitraum von 7 Tagen. Dies ermöglicht auch die aller potentiellen zellulären Quellen von Kardiomyozyten generation &quot;jagen&quot; und ermöglicht die Quantifizierung der kumulativen cardiomyocyte Kerne Generation über diesen Zeitraum. Je nach Studie kann dieser Zeitraum eingestellt werden, um die vorhergesagten Niveaus der Kardiomyozyten Generation gerecht zu werden. Für die genaue Quantifizierung von EdU Inkorporation in Kardiomyozyten Kerne, ist es unerlässlich, dass es keine nicht-spezifische Markierung der Kerne mit dem sekundären Antikörper verwendet werden, um PCM-1 Reaktivität nachzuweisen. Es wäre daher sinnvoll sein, zusätzliche sekundäre Antikörper Titrationsexperimente durchzuführen, um diesen Aspekt des Protokolls zu optimieren, insbesondere, wenn ein sekundärer Antikörper anders als das vorgeschlagen in diesem Protokoll verwendet werden soll. Das hier beschriebene Protokoll verwendet PCM-1-Expression cardiomyocyte Kerne zu identifizieren. Während dies eine etablierte Kardiomyozyten Marker ist, können alternative Marker verwendet werden, um zu überprüfen,Daten; Dazu gehören Antikörper , die spezifisch für die kardiale Troponin T , die als teilweise in Kardiomyozyten Kerne 1 lokalisiert identifiziert wurde. In ähnlicher Weise alternative Kern lokalisierte Proteine ​​verwendet werden können EdU Inkorporation in Kerne Populationen andere als die der Kardiomyozyten zu identifizieren und zu quantifizieren. Es ist wichtig, dass alle cardiomyocyte Kerne, die aktive Mitose durchlaufen werden von der Analyse ausgeschlossen, da das Schicksal dieses DNA-Synthese bekannt ist, und kann zu entweder der Zellteilung oder erhöhte Ploidie. PCM1 wird deshalb durch Mitose PCM1 Expression nicht Kardiomyozyten läuft während der M-Phase des Zellzyklus zerlegt identifiziert werden. Darüber hinaus werden alle Kerne in der S-Phase des Zellzyklus sollte eine nachfolgende Analyse ausgeschlossen werden. Dies kann durch die Ausblendung aller Kerne mit DAPI Intensität oberhalb der 2N Bevölkerung einschließlich derjenigen mit einer DAPI Intensität zwischen 2N und 4N Populationen erreicht werden. Obwohl es zunehmendangenommen, dass das Herz die Fähigkeit Kardiomyozyten während der normalen Alterung und nach einer akuten Verletzung zu ersetzen hat, bleibt die Quelle und das Ausmaß dieses Potential umstritten. Darüber hinaus haben unterschiedliche Raten von Kardiomyozyten Umsatz wurde 1,7,20-22 berichtet. Dies kann aufgrund der Schwierigkeiten teil werden in genau der Identifizierung und Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation 19. Bis heute wurden die meisten Studien stützte sich nur auf die Verwendung von histologischen Analyse und die Identifizierung von Kardiomyozyten über die Expression von cytoplasmatischen Proteinen, einschließlich Proteine ​​des Sarkomers, für die Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Erneuerung 2,4,23,24. Die Verwendung dieser Methoden, um die Expression von Proliferationsmarker zu detektieren, oder wie hier gezeigt, kann der Einbau von Thymidin-Analoga leicht in der Fehlidentifizierung von anderen kardialen Zelltypen wie Kardiomyozyten führen. Während die Verwendung von bildgebenden 3D-konfokalen kann diese Probleme zu lindern helfen these Methoden sind teuer und zeitraubend. Interessanterweise beschrieben das Protokoll hier demonstriert neo-Kardiomyozyten Kerne Generation mit einer Rate von 0,17% erfolgt pro Woche. Dies steht im Einklang mit anderen Durchflusszytometrie basierte Studien , die zeigen Wochenumsatz von bis zu 0,13% 5. Obwohl es verlockend ist jährlichen Umsatzraten zur Extrapolation auf der Grundlage dieser Daten, wie es in früheren Studien 2,5,25,26, das ist unangemessen , da die Preise des Umsatzes während ihres Lebenszyklus eines Tieres 13 dynamisch sind. Dieses Verfahren hat eine Reihe von möglichen Anwendungen, einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und die Raten der Kardiomyozyten Polyploidisierung zu verbessern.

In den letzten Jahren hat es eine Ansammlung von Beweisen Anfechtung der Annahme gegeben , dass das Herz eine terminal differenzierte, post-mitotischen organ 1,2 ist. Allerdings Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration bleibt eine Herausforderung. Die Schwierigkeiten bei der genauen selten Kardiomyozyten Generation unter Verwendung von Standard immunhistochemischen Techniken zu identifizieren sind gut 3 berichtet. Darüber hinaus bleibt die zelluläre Quelle der Kardiomyozyten Generation unsicher mit Beweis für Beiträge von Kardiomyozyten Proliferation sowie durch Stammzelldifferenzierung 4-6. Daher ist die Verwendung von lineage Verfolgungsmodelle Kenntnis der Kardiomyozyten-Vorläufer Phänotyps erforderlich ist unmöglich, und die Quantifizierung der Proliferation in einer Population, einschließlich Kardiomyozyten, ungeeignet ist. Weiterhin ist ein cardiomyocyte das Potential für Endoreplikation ohne karyokinesis hat (was zu einer polyploiden Autodiomyocyte) oder karyokinesis in Abwesenheit von Zytokinese (was zu einem zweikerniger cardiomyocyte) 7,8. Die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz hängt von der Fähigkeit zwischen diesen Ereignissen und wahre neo-Kardiomyozyten Generation zu unterscheiden. Dies schafft einzigartige Komplikationen , da die DNA - Replikation und Expression von Cyclin-abhängigen Kinasen in Kardiomyozyten nicht ausschließlich wahr Zelle zeigen Teilung 9,10. Zur Unterstützung bei der Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation haben wir eine etablierte Zellkerne Isolationstechnik und immunologische Markierung von pericentriolar Material 1 (PCM1) für Kardiomyozyten Kerne Identifizierung kombiniert , wie von Bergmann et al. 7,11 mit neuartigen Verfahren der langfristigen DNA-Markierung und Ploidie-Analyse. PCM-1 ist ein Zentrosomen Protein, das an der Kernfläche der differenzierten, nicht-teil Myozyten ansammelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Antikörper demonstriert gegenPCM-1 kennzeichnen spezifisch cardiomyocyte Kerne 7,11 und als solche PCM1 durch eine Anzahl von unabhängigen Gruppen verwendet wurde Kardiomyozyten 1,12,13 zu identifizieren. Darüber hinaus haben wir gezeigt , dass PCM1 Ausdruck zuordnet genetisch markierten Kardiomyozyten Kerne in der TnT-cre transgenes Mausmodell 14 (Supplementary Abbildung 1). Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue und empfindliche Identifizierung von neo cardiomyocyte Kerne Erzeugung im Mäuseherz, unabhängig von den zellulären Ursprung (1A und B) , während gleichzeitig Nukleosid Kennzeichnung ohne aufgrund Polyploidisierung aus der Analyse (Abbildung 1C und D). Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne, die für die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz erforderlich ist. Außerdem,es stellt ein schnelles Screening-Tool mögliche Veränderungen in der Dynamik der Kardiomyozyten Generation zu bewerten. Während DNA-Markierung in der Regel 5-Bromo-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) als das Thymidin-Analogon beschriebene Protokoll verwendet hier einen 5-ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EDU) basierenden Assay, da es weniger Verarbeitungsschritte für einen rascheren erfordert Durchsatz und erfordert nicht für Immun-Detektion der DNA-Denaturierung es kompatibel mit anderen immunostaining Protokolle zu machen und dadurch die möglichen nachgelagerten Anwendungen des Verfahrens zu erhöhen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Abbildung 1: Kontinuierliche Pulsieren mit EdU Etiketten neo-Kardiomyozyten unabhängig von ihrer Vorläufern. (A) EdU wird in die DNA von Kardiomyozyten während der Zellteilung einbezogen. Proliferation in der Kardiomyozyten Bevölkerung Result in einer Erhöhung oder Ersatz von Kardiomyozyten und ist deshalb produktiver DNA-Synthese (trägt zur Gewebe Wartung und Reparatur). (B) EdU wird in die DNA von Herzvorläuferzellen während der Zellteilung einbezogen. Dies wird in der Zelle während der Differenzierung in die Kardiomyozyten lineage beibehalten werden. Diese Stammzelldifferenzierung wird auch in einer Erhöhung der Anzahl von Kardiomyozyten führen und trägt daher zur Gewebe Wartung und Reparatur. (C) Kardiomyozyten haben das Potenzial , &quot;nicht-produktive&quot; DNA - Replikation zu unterziehen , zu einer erhöhten Kardiomyozyten Ploidie führt, die mit Kardiomyozytenhypertrophie und das myokardiale Remodeling assoziiert ist, ersetzt aber nicht verloren Kardiomyozyten. Der Prozess der Polyploidisierung unterscheidet sich von binucleation wie es in einem Kardiomyozyten mit einem einzelnen Kernen führt, die vier oder mehr Sätze von zwei homologen Chromosomen enthalten (&gt; 2N). (D) Nach einem kontinuierlichen Kerne pUlse Dieses Protokoll beschreibt Kerne Isolierung und Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne durch PCM1 Ausdruck Quantifizierung sowohl Kardiomyozyten Ploidie und EdU Einbau zu ermöglichen. PCM1 - Expression und EdU Einverleibung Durchflusszytometrie detektiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

Obwohl es angenommen wird, dass das Herz ein begrenztes Potential hat Kardiomyozyten nach Verletzungen und dass niedrige cardiomyocyte Umsatz treten während der normalen Alterung, Quantifizierung dieser Ereignisse zu regenerieren bleibt eine Herausforderung. Dies wird teilweise aufgrund der Seltenheit des Verfahrens und der Tatsache, dass mehrere Zellquellen myocardial Wartung beizutragen. Darüber hinaus innerhalb Kardiomyozyten DNA Vervielfältigung führt oft zu einer polyploid Kardiomyozyten und führt nur selten zu neuen Kardiomyozyten durch Zellteilung. Um zu genau Kardiomyozyten Umsatz Unterscheidung zwischen diesen Prozessen zu quantifizieren wesentlich. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Langzeit Nukleosid Kennzeichnung, um alle Kerne zu bezeichnen, die durch die Verwendung von Kernen Isolierung und anschließende PCM1 Immunmarkierung identifiziert als Ergebnis der DNA-Replikation und Kardiomyozyten Kerne entstanden sind. Zusammen ermöglicht dies eine genaue und empfindliche Identifizierung der Nukleosid Kennzeichnung des cardiomyocyte Keimpopulation. Weiterhin, 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol Markierung und Analyse von Kernen Ploidie, ermöglicht die Unterscheidung von neo-Kardiomyozyten Kerne aus Kernen, die während Polyploidisierung Nukleosid eingebaut haben. Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne während für Polyploidisierung ausmacht. Dieses Verfahren hat eine Anzahl von Downstream-Anwendungen einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und Ploidie zu erhöhen. Diese Technik ist auch kompatibel mit zusätzlichen nachgeschalteten immunhistologische Techniken, so dass die Quantifizierung von Nukleosid-Inkorporation in allen kardialen Zelltypen.

Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung von erhöhten EdU Inkorporation aufgrund cardiomyocyte Kerne Teilung während für erhöhte Polyploidisierung steuern. Unter Verwendung eines BrdU basierten Assays, wir haben bereits gezeigt , dass das Säugetier-Herz reagiert auf chronische Kardiomyozyten Verlust, in der MDX - Maus - Modell der Duchenne - Muskeldystrophie, mit der Regeneration der neuen Kardiomyozyten. Wir haben die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um unsere veröffentlichten Ergebnisse validieren und die Nützlichkeit des Protokolls zu demonstrieren. Gemäß dem Protokoll beschrieben; Erwachsener (12 Wochen alt) MDX und Kontrolle BL10 Mäuse mit einer täglichen Injektion von EdU für 7 Tage gepulst wurden, berichtete zuvor 5,13 statisch Analyse zwischen experimentellen Gruppen zu ermöglichen. Immunhistologische Analyse gepulster Herzen zeigt die Anwesenheit von PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten , die EDU (3A) eingearbeitet haben. Jedoch usin die erhaltenen Dateng immunhistologischen Methoden können falsch interpretiert werden, als andere Zelltypen, die EdU integriert haben können als Kardiomyozyten falsch identifiziert werden. Ein Beispiel hierfür ist in Ergänzungs 1A und B gezeigt. Außerdem immunhistologische Methoden unterscheiden nicht Polyploidisierung von Kernteilung. Die Durchflusszytometrie Analyse in diesem Protokoll detailliert ermöglicht die schnelle Quantifizierung von Kardiomyozyten Kernteilung in MDX und Kontrollmäuse, während ohne Zellen , die EdU aufgenommen hatte aufgrund Polyploidisierung. Ähnlich wie bei den zuvor veröffentlichten Daten 13, die Analyse ergab einen Anstieg der Preise von neo-Kardiomyozyten Kerne Generation in der MDX - Mäuseherzen im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollgruppe (1,2% im Vergleich zu 0,17%; 3B und C). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Figur 3: </strong&gt; Die Quantifizierung von EdU markierten Kardiomyozyten in Wildtyp- und MDX - Herzen. (A) Bild von 40 &amp; mgr; m dicke Abschnitte von MDX Herzen genommen Z-Stack - Projektionen. PCM-1-exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün), die EDU (rot) aufgenommen hat. Gelber Pfeil zeigt EdU Kardiomyozyten markiert. i und ii anzeigt einzelnen EdU Kardiomyozyten gezeigt in der Z-Ebene bezeichnet. Nuclei markiert mit DAPI (blau) (B und C) Durchflusszytometrie von isolierten Kernen zeigt repräsentativen Parzellen von 12 bis 13 Wochen alten Wildtyp (C57 / BL10) und mdx - Mäusen (MDX - / y auf dem C57 / BL10 Hintergrund). (B) Histogramm zeigt DAPI Intensität und Diskriminierung zwischen 2 N und&gt; 2 N Kernen. (C) Plots zeigt EdU Einbau in den 2N Kardiomyozyten Keimpopulation , wenn sie in diesem Protokoll so detailliert analysiert. Für alle Mäuse wurde Edu für 1 Woche ab 1 verabreichtAlter von 2 Wochen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ergänzende Abb . 1: PCM-1 ist ein spezifischer Marker für Kardiomyozyten Kerne unter Verwendung des Protokolls beschriebenen Kerne aus der doppelt transgenen Maus durch Kreuzung TNT-cre Mäusen isoliert wurden 14 mit dem ROSA nT / nG cre - sensitives Reporterlinie 16. In der resultierenden Maus cre Aktivierung unter der Kontrolle von Troponin T (TNT) Promotor führt zu irreversiblen Expression von GFP mit den Kernen lokalisiert ist. Nuclei, markiert mit Isotypkontrollreagenzien (Iso) zeigt die Fähigkeit der GFP exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation (488/530/30-A) zu identifizieren. Die Markierung von Kernen mit anti-PCM1 (sekundärer Antikörper nachgewiesen durch 633-660 / 20-A) zeigt die Korrelation von PCM1 Ausdruck mit dem GFP-exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation. In diesem Beispiel 98,8% der Kardiomyozyten Kerne wie durch TNT Promotoraktivität identifiziert, durch PCM1 Antikörper markiert sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 1 zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">.</a> Ergänzende Abbildung 2:. Herausforderungen für die durch immunhistologische Techniken Kardiomyozyten Erneuerung Quantifizierung (A) 2D - Bild zeigt zwei PCM-1 - exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün) , die auch für EdU (rot) markiert angezeigt werden. Gelbe Pfeile zeigen an, was Kardiomyozyten zu sein scheint, die EdU integriert haben. Dies ist aufgrund der scheinbaren Kolokalisation von PCM1 Expression und EdU Kennzeichnung wenn 2-dimentional Bildgebung sichtbar gemacht werden. (B) Ein 3-dimensionale Projektion dieses Bildes identifiziert die EdU markierten Zellen nicht Kardiomyozyten sind aber sind nicht-Kardiomyozyten Zellen PC überlagerndenM1 zum Ausdruck Kardiomyozyten Kerne. C57 / BL10 - Mäuse im Alter von 12 Wochen für Experimente verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 2A zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 2B zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaktionskomponenten </td><td colspan="2"> Anzahl der Reaktionen </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 &amp; mgr; l </td><td> 2,19 ml </td></tr><tr><td> Copper protectant </td><td> 20 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Fluoreszenzfarbstoff Picolylgruppe Azid </td><td> 5 ul </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Verwässertes Reaktion-Puffer in 4.1 </td><td> 100 ul </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Die gesamte Reaktionsvolumen </td><td> 1 ml </td><td> 2,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: EdU Cocktail Zutaten. Rezept für EdU Kennzeichnung Cocktail in Protokollabschnitt 4 (Nachweis von EdU-Einbau) erforderlich.

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Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Aufrufe.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Forschung

Genetik

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Entwicklungsbiologie

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medizin

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Biotechnik

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting bona fide heart regeneration limits the validation of potential regenerative factors. One method to detect new cardiomyocytes is multicolor lineage tracing with clonal analysis. Clonal analysis experiments can be difficult to undertake, because labeling conditions that are too sparse lack sensitivity for rare events such as cardiomyocyte proliferation, and diffuse labeling limits the ability to resolve clones. Presented here is a protocol to undertake clonal analysis of the neonatal mouse heart by using statistical modeling of nearest neighbor distributions to resolve cardiomyocyte clones. This approach enables resolution of clones over a range of labeling conditions and provides a robust analytical approach for quantifying cardiomyocyte proliferation and regeneration. This protocol can be adapted to other tissues and can be broadly used to study tissue regeneration.

Presented here is a protocol for using multicolor lineage tracing and nearest-neighbor modeling to identify clonally derived cardiomyocytes during growth and regeneration in mice. This approach is objective, works across different labeling conditions, and can be adapted to incorporate a variety of image analysis pipelines.

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

Modell der ischämischen Herzkrankheit und videobasierter Vergleich der Kardiomyozytenkontraktion mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...