Die in diesem Artikel vorgestellte Methode entstand aus der Arbeit durch die BBSRC BB / finanziert I021507 / 1 (TB, RJTW) und eine MRC Doktor studentship (MH).

Hinweis: Alle Experimente wurden mit entsprechend den Kings College London, Großbritannien und die britische Innenministerium Tierpflege-Richtlinien durchgeführt. 1. Präparation der e14 Cerebellum <ol><li> Braun befruchteten Hühnereiern Inkubation bei 38 ° C zu embryonalen Tag 14. </li><li> Mit Ei Schere enthaupten Hühnerembryo in ovo, und entfernen Sie den Kopf auf eine Petrischale mit eiskaltem PBS (Abbildung 1A). </li><li> Verwendung von Standard-Pinzette, machen Einschnitte hinter jedem Auge den ganzen Weg durch das Gewebe, das Entfernen der Augen und Oberkiefer. Einen zweiten Schnitt ganz durch den Rachen Entfernen des Unterkiefers (Abbildung 1B). </li><li> Verwendung von Standard-Pinzette, entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels durch Abziehen es weg (Abbildung 1c), und entfernen Sie frontalen und parietalen Knochen und enthüllt Gehirn. </li><li> Aus einer ventralen Seite, entfernen Rachen Knorpel und Hilfs Mesenchym. </li><li> Aus einer dorsalen, vorsichtigly entfernen Mesenchym dorsal der Hinterhirn dabei nicht pia und separate gesamte Gehirn (1D) beschädigen. </li><li> Machen Einschnitt den ganzen Weg durch das Gewebe zwischen Mittelhirn und Hinterhirn und Hinterhirn separaten einschließlich Kleinhirn (1E). </li><li> Durch Einschnitte den ganzen Weg durch das Gewebe an beiden seitlichen Übergängen von Kleinhirn und Flügelplatte des Hinterhirn, entfernen gesamte Kleinhirn, kümmert sich um die Integrität der Pia gesamten Dissektion (1F) zu halten. Entfernen Sie die bildenden Plexus (1G). </li><li> Bewegen Sie den seziert Kleinhirn in eiskaltes HBSS. </li></ol> 2. Scheibe Kultur von e14 Cerebellum <ol><li> Übertragen die gesamte Kleinhirn in den sterilen Plattform einer Tissue Chopper mit einem Spatel oder ein 3 ml Pasteurpipette mit der Spitze weggeschnitten ist, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette. </li><li> Schneiden gesamte Ganze Kleinhirn in ter benötigt Orientierung bei 300 &amp; mgr; m Dicke mit dem Gewebe Chopper mit einer Schnittgeschwindigkeit eingestellt auf 50% des Maximums. Gewebeintegrität wird am einfachsten im Sagittalschnitt bewahrt; jedoch ist die Orientierung auch ein wichtiger Gesichtspunkt für die Zellanalyse (Purkinjezelle Dendriten sagittal ausgerichtet sind, während die Körnerzell Axone verlaufen quer, senkrecht zur Ebene der Purkinje Zelle Dendriten). </li><li> Mit einem 3 ml Pasteurpipette, decken Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn in eiskaltem HBSS. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben in HBSS auf eine 60 mm Petrischale mit Eis kalte Frisch HBSS mit einem 3 ml Pasteurpipette mit geschnittenen Spitze. </li><li> Unter einem Binokular mit einem faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird, sicherzustellen, Trennung der einzelnen Scheiben mit Uhrmacher Pinzette. Identifizieren Scheiben elektroporiert werden, auf der Grundlage ihrer Gewebeintegrität und medio-laterale Position. Hinweis: Jeder Dissektion vom Embryo bis zur Inkubation in Kulturmedium in Scheiben schneiden dauert etwa 10-20 min je upon-Erlebnis. Zuführen Dissektionen eine zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass cerebella verbringen minimalen Zeitspanne zwischen Dekapitation und ex vivo-Kultur. </li></ol> 3. Elektroporation von Slices <ol><li> Konstruktion eines Elektroporationskammer durch Fixieren der Anode einer Elektroporator auf der Basis einer 60 mm Petrischale mit Isolierband. In etwa 1 ml HBSS, um die Elektrode zu bedecken. </li><li> Legen Sie eine 0,4 um Kultureinsatz an der Spitze der Elektrode in HBSS bedeckt. Lassen Sie das Kultureinsatzes auf die Elektrode dafür sorgen, gibt es immer zwischen dem Einsatz und der Elektrode kontaktieren ausruhen. Hinweis: In dieser Konfiguration wird der Kultureinsatz mit den Scheiben auf die Oberfläche der Lösung liegen, die Aufrechterhaltung der Schaltung, sondern ermöglicht räumliche Ausrichtung der Kathode. </li><li> Transfer identifizierten Scheiben (bis zu fünf pro Kultureinsatz) auf Kultureinsatz mit 3 ml Pasteurpipette mit dem Schnitt Spitze. Separate und lassen Sie sie in einem sagitt auf Kultureinsatzes absetzenal Ausrichtung. </li><li> Mit einer Pipette entfernen überschüssiges HBSS, so dass Scheiben sind in der Lösung nicht mehr gebadet. </li><li> Verwendung einer P10-Pipettenspitze, einer Pipette DNA (bei einer Konzentration von 1 ug / ul) mit 20% Fast Green über die Oberfläche der Zielregion einer Scheibe verdünnt. 20% schnell grün sorgt für viskose DNA-Lösung und verhindert, dass übermäßig breite Streuung der DNA. In etwa 5 &amp; mgr; l DNA / schnell grün Lösung für jede Scheibe (2B). </li><li> Legen Sie die Kathode über gewünschte Zielgewebe und elektroporieren mit 3 x 10 V, 10 ms Dauer Impulse. Vermeiden Sie direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe. Stattdessen profitieren Sie von der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, um Leitfähigkeit zu halten (platzieren Sie die Kathode so nah an das Gewebe wie möglich, ohne zu berühren das Gewebe). </li><li> Wiederholen DNA Lieferung und Elektroporation, um mehrere Regionen der EGL auf jedem einzelnen Kleinhirn Scheibe nach Wunsch. </li><li> Nach Abschluss der Elektroporation, Transfer Kultur insert bis 30 mm Petrischale. </li><li> Zu jeder Kultur, 1 ml der vorgewärmten Kulturmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - Glucose, 1% B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) unter dem Kultureinsatz, so dass die Kultureinsatzes in Kontakt mit dem Medium, aber Scheiben sind nicht in sie getaucht. </li><li> Kulturen, die bei 37 ° C / 6% CO 2 inkubieren bis 3 Tage. Ersetzen Sie den gesamten Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Medium. </li><li> Nach der Kultur, zu beheben Scheiben auf Kultureinsätze für 1 Stunde in 4% Paraformaldehyd (oder O / N bei 4 ° C) in einem frischen 30-mm-Schale ohne Kulturmedien. </li></ol> 4. Imaging von Kleinhirn-Slices <ol><li> Nach der Fixierung, Waschen Scheiben 3 mal 5 min in PBS. </li><li> Mit einer Rasierklinge, sezieren jede Elektroporation und kultivierten zerebellären Scheibe aus dem Kultureinsatzes durch Schneiden um die Scheibe und das Entfernen der Scheibe und den Bereich der Einsatz es eingehalten wird. MachenVersuchen Sie nicht, Scheibe aus der Kultur Einsatzoberfläche zu entfernen. </li><li> Berg Scheiben in etwa 1 ml Eindeckmedium enthält DAPI (falls gewünscht) unter einem Deckglas dabei nicht zu Blasen einzuführen und Bild mit Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie. Anmerkung: Bildparameter können gemß den Konstrukten elektroporiert variiert werden und liegt im Ermessen des jeweiligen Benutzers. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Protokoll hier berichteten beschreibt ein Verfahren zum Präparieren, Elektroporation und Kultivieren Scheiben embryonalen Tag 14 Kleinhirn von der Küken. Dieses Protokoll ermöglicht Targeting der Elektroporation zur kleinen Brenn Regionen der EGL, einschließlich isolierten Ausrichtung der einzelnen Kleinhirnlappen. Es ermöglicht die genetische Analyse und Bildgebung mit einer hohen Auflösung und Bequemlichkeit, und zu geringen Kosten im Vergleich zu etablierten Techniken in Nagetieren 43-47. Eine so...

Das Kleinhirn sitzt am vorderen Ende der Hinterhirn und ist für die Integration von sensorischen und motorischen Verarbeitung im reifen Gehirn verantwortlich sowie die Regelung höhere kognitive Prozesse 1. In Säugetieren und Vögeln, eine aufwendige Morphologie besitzt sie und ist stark blättrigen, ein Produkt der umfangreichen Transit Amplifikation von Vorläuferzellen während der Entwicklung, die mehr als die Hälfte der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn produziert. Das Kleinhirn ist für Neurobiologen seit Jahrhunderten und in der molekularen Ära ein Thema der Studie hat ebenfalls erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Dies bezieht sich nicht nur auf ihre inhärent interessante Biologie, sondern auch auf die Tatsache, dass es stark in menschlichen Erkrankungen einschließlich Entwicklungs genetische Störungen wie Autismus 2 und am deutlichsten Kleinhirnkrebs, Medulloblastom 3, die die häufigste pädiatrische Gehirn beteiligt ist Tumor. Wichtig ist, dass es ein ausgezeichnetes Modellsystem im which dem Schicksal Allokation und Neurogenese während der Gehirnentwicklung 4 studieren. In den letzten Jahren hat es sich auch als Modellsystem für die vergleichende Untersuchung der Entwicklung des Gehirns festgestellt wurde, auf Grund der großen Vielfalt von Formen für die Kleinhirnwirbel phylogeny 5-10 ersichtlich. Das Kleinhirn entwickelt sich von der dorsalen Hälfte Rhombomer 1 im Hinterhirn 11 und entwicklungs besteht aus zwei primären Vorläuferpopulationen, die Rautenlippe und der ventrikulären Zone zusammen. Die rhombische Lippe erstreckt sich um den dorsalen Bereich des Neuroepithels des Rautenhirns an der Grenze mit dem Dachblech. Es ist der Geburtsort der glutamatergen erregenden Neuronen des Kleinhirns 12-14. Die ventrikuläre Zone führt zu den inhibitorischen GABAergen Neuronen des Kleinhirns, allen voran die großen Purkinje Neuronen 14,15. Später in der Entwicklung (von etwa embryonalen Tag 13,5 in Maus; e6 in chick 16), glutamatergen PROGENitors tangential wandern von der Rautenlippe und bilden eine Schicht der Pia-Vorläuferzellen: eine sekundäre Vorläuferzone genannt externen Körnerschicht (EGL). Es ist diese Schicht, die den umfangreichen Transit Verstärkung, die auf die große Zahl von Körnerzellen im reifen Gehirns führt erfährt. Proliferation im EGL seit langem zum Teil pial Platz, in tangentiale Migration vom rhombischen Lippe 17 führt in Verbindung gebracht worden, wobei der Schalter auf den Zellzyklus verlassen und die neuronale Differenzierung von Vorläufern mit ihrem Austritt aus dem Außen EGL Schicht in der Mitte zugehörigen EGL 18. Umfangreiche tangentiale Migration von postmitotischen Körnerzellen im medial-laterale Achse erfolgt in der mittleren und inneren EGL 19, vor dem abschließenden radialen Wanderung in die innere Körnerschicht des reifen Kleinhirnrinde. Migration von Zellen aus dem rhombischen Lippe über der Kleinfläche abhängt CXCL12 Signalisierung vom pia 20-22 </sup&gt; Und Körnerzellen exprimieren das CXCL12-Rezeptor CXCR4. Ihre tangentiale Migration ist somit erinnert an die des Neokortex tangential Migration hemmenden Intern Bevölkerung 23-25. Interessanterweise elektronenmikroskopischen Untersuchungen 17 haben vorgeschlagen, dass die EGL-Zellen mit einer proliferativen Morphologie beizubehalten Pia-Kontakt, die Verknüpfung Zellverhalten mit proliferative Fähigkeit in einer Art und Weise erinnert an die basalen Vorläuferzellen der Säugetier Cortex 26. Dies wird in der vorgenannten Schichtung der EGL in drei Unterschichten, die durch verschiedene extrazelluläre Umgebungen und wo Körnchen Vorstufen haben verschiedene Genexpressions 18 definiert sind, reflektiert wird. Proliferation von Vorläufern im oEGL tritt mit einer Normalverteilung von Klon Größen, so dass zu einem Medianwert von 250-500 g postmitotischen wenn Progenitoren einzeln genetisch am Ende der Embryonalentwicklung der Maus markiert, sie gebenranule Neuronen 27,28. Proliferation ist abhängig von mitogenen SHH-Signalisierung von der zugrunde liegenden Purkinje Neuronen 29-32. Die Fähigkeit, auf Shh antworten hat sich gezeigt, völlig abhängig von zellautonomen Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 zu sein, sowohl in vitro als auch in vivo 33 34,35. Ebenso Zellzyklus verlassen und Differenzierung wurde gezeigt, abhängig von der Expression des Downstream-Transkriptionsfaktor NeuroD1 36, die wahrscheinlich eine direkte Repressor Atoh1 37 sein. Trotz dieser Fortschritte und erheblichen Fortschritt in der Entzifferung der zellbiologischen Grundlagen der Zellzyklus-Ausgang 38-42, die grundlegende molekulare Mechanismus (n), die die Entscheidung zugrunde liegen, die den Zellzyklus zu verlassen und von einem Stammvater zu einem differenzierenden Neuronen übergehen, und die assoziierten postmitotischen tangentiale Migration im inneren EGL sowie die später Schalterum die radiale Migration, bleiben unvollständig verstanden. Dies ist zu einem großen Teil aufgrund der experimentellen intractability der EGL: es spät entwickelnden und genetisch schwer gezielt da viele der neurogenen Moleküle sind auch entscheidend früher im Leben der Granulat Vorstufen am rhombischen Lippe. Um dieses Problem zu überwinden, wurden zahlreiche Autoren in vivo und ex vivo Elektroporation als eine Methode, um die postnatale Kleinhirn bei Nagern 43-48 Ziel entwickelt. Hier haben wir Pionierarbeit in der Verwendung von ex vivo Elektroporation in Küken, die EGL, die erhebliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Bequemlichkeit stellt studieren. Unsere Methode der Elektroporation und ex vivo Schnittkultur von Chick Kleinhirngewebe verwendet Gewebe aus embryonalen Tag seziert 14 Küken auf dem Höhepunkt der EGL Verbreitung. Diese Methode ermöglicht es genetische Targeting des EGL unabhängig rhombischen Lippe und die Bühne für Genetik der Übergang vom Granulat eingestelltVorläufer zu postmitotischen Granulat Neuronen im Kleinhirn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Die Kleinhirn externen Körnerschicht (EGL) ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn, und ein hervorragendes Modell für neuronale Proliferation und Differenzierung des Studiums. Darüber hinaus evolutionären Modifikationen ihrer Proliferationsfähigkeit wurden für die dramatische Ausweitung der Kleinhirngröße in den Amnioten verantwortlich, so dass das Kleinhirn ein hervorragendes Modell für Evo-Devo-Studien des Wirbeltiergehirns. Die konstituierenden Zellen der EGL, Kleinhirn-Körnervorläuferzellen, auch einen signifikanten Zellherkunfts stellen für Medulloblastom, die am häufigsten pädiatrischen neuronalen Tumor. Nach dem Transit-Amplifikation, Granulat Vorstufen migrieren radial in die innere Körnerschicht des Kleinhirns, wo sie den größten neuronalen Population im reifen Gehirn von Säugetieren dar. In chick, der Höhepunkt der EGL Proliferation tritt gegen Ende der zweiten Woche der Schwangerschaft. Um genetische Veränderung auf diese Schicht bei Targetder Peak der Proliferation, haben wir ein Verfahren zur genetischen Manipulation durch ex vivo-Elektroporation von Cerebellum Scheiben aus embryonalen Tag 14 Kükenembryos entwickelt. Dieses Verfahren faßt einige wichtige Aspekte der in vivo Granulatneuronenentwicklung und ist nützlich bei der Erzeugung ein gründliches Verständnis der Kleinhirn-Körnerzellproliferation und -differenzierung sein, und damit der Kleinhirn-Entwicklung, Evolution und Krankheit.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Ergebnissen, die unter Verwendung von Scheiben Elektroporation und die Kultur des Kleinhirns aus embryonalen Tag 14 Küken gewonnen werden können. Die Präparation des Kleinhirns ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Elektroporationskammer einzurichten ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir zeigen, dass es möglich ist, Kultur Kleinhirnschnitten, die ihre Struktur und Zellmorphologie in vitro</...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K Aufrufe.  King's College London.  Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen. 

Serie: Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

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