Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant OD031956 und den NICHD R01 Grant HD073104 unterstützt. Wir danken Darcy Kelly für hilfreiche Diskussionen und erste Anregungen zu diesem Protokoll. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert, Jill Ralston und Wil Ratzan für ihre Hilfe und Unterstützung sowie bei unseren drei anonymen Peer-Reviewern für ihr Feedback bedanken.

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt.
ANMERKUNG: Obwohl die beschriebene primäre Methode der Euthanasie von der American Veterinary Medical Association12 als akzeptable Technik für die Euthanasie angesehen wird, wurde nicht festgestellt, dass sie zum Stillstand eines Herzschlags führt13. Auch die häufig angewandte sekundäre Methode des doppelten Sagenmachens verhindert dies nicht, ebenso wenig wie die Entnahme des Herzens aus dem Tier. Die Ausblutung von betäubten Tieren gilt als humane und effektive Methode für eine erfolgreiche Euthanasie12. Da die Erhaltung von frischem Gewebe durch Euthanasie das Ziel dieses Protokolls ist, ist es von Vorteil, dass das Herz während der primären Euthanasie mit MS-222 weiter schlägt und dass die Perfusion selbst eine sekundäre Euthanasiemethode durch Ausblutung ist.
1. Vorbereitung
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasie- und Perfusionstechnik genehmigt hat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricainmethansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat vor. Das Volumen sollte größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig zu bedecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 μl 180 U/ml Heparin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro X. laevis oder 200 μl pro X. tropicalis vor.</li>
	<li>Führen Sie eine primäre Euthanasie durch, indem Sie den Xenopus in diese Lösung geben (aus Schritt 1.2). Das Tier bleibt insgesamt 1 Stunde unter Wasser.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass der Xenopus seine Schmerzreaktion verloren hat, indem Sie den Fuß 15 Minuten nach der Euthanasie einklemmen. Wenn das Tier reaktiv ist, geben Sie es der Euthanasielösung zurück, bis diese Reaktion verloren geht.</li>
	<li>Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie alle zusätzlichen Messungen vor, die vor der Probenahme erforderlich sind.</li>
	<li>Injizieren Sie X. laevis mit einer 31-G-Nadel mit 250 μl und X. tropicalis mit 100 μl 180 U/ml Heparin in PBS (aus Schritt 1.3) in die Muskulatur jeder Vordergliedmaße.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 1 ml/g des Tiergewichts von 54 U/ml Heparin in PBS-Perfusat vor. Personen, die mehr Erfahrung mit diesem Protokoll haben, können feststellen, dass weniger Medien erforderlich sind, um die Perfusion abzuschließen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 22 g Injektionsnadel für die Perfusion von X. laevis und eine 25 g Injektionsnadel für X. tropicali s. Stumpfen Sie die Perfusionsnadel, indem Sie die Spitze mit einem Drahtschneider abschneiden (Abbildung 1)14. Anmerkungen: Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Nadel durch die Herzkammer perforiert, wenn sie verschoben wird. Zusätzlich zur Abstumpfung kann die Nadel mit einem Schleifstein oder einer Feile leicht abgeschliffen werden, bleibt aber immer noch scharf genug, um die Herzkammer zu durchbohren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Pumpe vor, indem Sie die gekürzte Nadel anbringen und 54 U/ml heparinisiertes PBS-Perfusat zirkulieren lassen (aus Schritt 1.8). Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden, um die Möglichkeit einer Luftembolie auszuschließen, die zu einer verminderten Perfusionseffizienz oder einem Versagen führt (siehe Tabelle 1). Bewahren Sie das Perfusionsmedium für die Dauer des Eingriffs auf Eis auf.</li>
	<li>Wenn die Pumpe nicht programmierbar ist, messen Sie bei eingesetzter Nadel das Fördervolumen des Mediums unter den verschiedenen Einstellungen, um zu bestimmen, welche Einstellungen 5 ml/min und 10 ml/min am nächsten kommen. Diese Durchflussraten werden unabhängig von der Art verwendet. Wenn die Perfusionspumpe programmierbar ist, kalibrieren Sie sie mit eingesetzter Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Platzieren Sie die Dissektionsfläche (Schale oder Schaumstoffplatte) schräg in einem sekundären Behälter oder ordnen Sie sie so an, dass sie den Blutabfluss erleichtert.</li>
	<li>Sobald der Frosch 1 h in der Lösung war, ist die primäre Euthanasie abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion erneut, indem Sie einen Fuß kneifen lassen.</li>
	<li>Legen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie jedes Glied fest (Abbildung 2). Wenn das Gewebe der Gliedmaßen erhalten werden muss, können dünne Stifte durch die Finger oder U-förmige Klammern um die Gliedmaßen gelegt werden.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Sezierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, so dass zwei Klappen entstehen. (Abbildung 2)</li>
	<li>Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie von der Zölomhöhle weg (Abbildung 3). Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere durch die Muskulatur. Machen Sie zwei Klappen aus der Hohlraumwand und schneiden oder stecken Sie alle Klappen aus dem Weg.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Dissektionsschere, um die Coracoideusknochen zu durchtrennen und überschüssiges Gewebe wegzuschneiden, um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten (Abbildung 3).</li>
	<li>Das Herz sollte noch schlagen. Wenn das Herz vor der Perfusion aufgehört hat zu schlagen, beachten Sie, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.</li>
</ol>2. Perfusion
<ol><li>Identifizieren Sie den Magen und verschieben Sie ihn sanft so, dass er sich auf dem linken Leberlappen (auf der rechten Seite des Betrachters) befindet und sein Gefäßsystem für die Dauer des Eingriffs sichtbar ist. Identifizieren Sie eine Lunge und fassen Sie sie mit einer Gewebezange an der Spitze. Ziehen Sie die Lunge aus der Zölomhöhle heraus und stecken Sie sie durch die Spitze (Abbildung 4). Tun Sie dies vorsichtig, da geplatzte Blutgefäße nicht gut durchbluten. Achten Sie darauf, ob Blut im Lappen sichtbar ist, da dies die Fähigkeit beeinträchtigt, den Abschluss des Verfahrens zu bestimmen.</li>
	<li>Machen Sie ein Bild der Zölomhöhle, um die Perfusionseffizienz besser beurteilen und möglicherweise abnormales Gewebe zu einem späteren Zeitpunkt zu identifizieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange (Abbildung 5). Perforieren Sie den Herzbeutel vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu schneiden. Schäle den Herzbeutel von den drei Herzkammern weg.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den Ventrikel sanft an seiner Spitze zu fassen. Üben Sie einen begrenzten Druck aus, damit zwischen den Zugflächen der Pinzette genügend Platz für den Durchgang der Perfusionsnadel vorhanden ist (Abbildung 6).</li>
	<li>Führen Sie die Nadel durch den Verschluss der Pinzette in die Kammer der Herzkammer ein und achten Sie darauf, dass sie nicht durch die Herzkammer perforiert wird (Abbildung 7). Klemmen Sie die Gewebepinzette mit einem Nadelhalter mit einem Hämostaten fest. HINWEIS: Diese Technik stabilisiert die Position der Nadel, die immer noch scharf ist. Das Einklemmen der Nadel direkt in die Herzkammer führt ebenfalls zu unnötigen Schäden, was das Umspannen erschwert, falls dies erforderlich ist (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Starten Sie den Durchfluss der Pumpe bei ca. 5 ml/min. Die drei Kammern des Herzens und des Truncus arterielle werden anschwellen (Abbildung 8; siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Lanzen Sie mit einer Schere vorsichtig die rechte Ohrmuschel (links vom Betrachter); Blut wird herausfließen. Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml/min ein oder erhöhen Sie sie auf 10 ml/min.</li>
	<li>Fahren Sie fort, bis die Magengefäße blass sind (siehe Tabelle 1), dann lanzen Sie die linke Ohrmuschel des Herzens (rechts vom Betrachter). Wenn die Flussrate immer noch 5 ml/min beträgt, erhöhen Sie sie auf ca. 10 ml/min.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Zölomhöhle in Perfusionsmedien zu spülen, um die Sichtbarkeit zu erhalten und die Farbe des Perfusats, das aus den Ohrmuscheln fließt, besser beurteilen zu können.</li>
	<li>Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, bis das aus den Ohrmuscheln fließende Perfusat klar ist (siehe Tabelle 1) und die Lunge ihren roten Farbton verloren hat (siehe Tabelle 1; Abbildung 9).</li>
</ol>

Blutperfusion bei afrikanischen Krallenfröschen für die Transkriptomik und Proteomik

<ol>
	<li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum.">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog,+Xenopus+laevis+(Daudin):+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li><li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis+Daudin:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li><li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li><li>Miodo&#324;ski, A. J., B&#228;r, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+(Rana+temporaria,+Rana+esculenta).+Scanning+electron-microscopic+(SEM)+study+of+microcorrosion+casts.">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li><li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease.">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis.">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution.">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution.">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).</li><li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals,+2020+edition.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , 37 (2020).</li><li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+(Xenopus+laevis).">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America.">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li><li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vertebrate+heart:+an+evolutionary+perspective.">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li><li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+protocol+for+lizards,+including+a+method+for+brain+removal.">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.
Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung...

Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier für X. tropicalis und weniger als 15 Minuten pro X. laevis-Tier. Die sekundären Prioritäten sind die einfache Replikation und die Verwendung von leicht zu beschaffenden Geräten, so dass qualitativ hochwertige Proben zwischen den Xenopus-Laboren ausgetauscht werden können.
Xenopus-Frösche werden in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um grundlegende biologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die über Arten hinweg konserviert sind. Dieser Tetrapode hat eine engere evolutionäre Beziehung zu Säugetieren als andere aquatische Modelle, da er Lungen, ein Dreikammerherz und Gliedmaßen mit Fingern hat. Die internationale Gemeinschaft nutzt Xenopus effektiv, um durch eingehende Krankheitsmodellierung und molekulare Analyse der krankheitsbedingten Genfunktion ein tieferes Verständnis menschlicher Krankheiten zu erlangen. Die zahlreichen Vorteile von Xenopus als Tiermodell machen sie zu unschätzbaren Werkzeugen, um die molekularen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zu diesen Vorteilen gehören: große Eizell- und Embryogröße, hohe Fruchtbarkeit, einfache Unterbringung, schnelle äußere Entwicklung und einfache genomische Manipulation. Es wird geschätzt, dass Xenopus ~80% der identifizierten menschlichen Krankheitsgene teilen7.
Im Vergleich zu populären Säugetiermodellen ist Xenopus ein schnelles, kostengünstiges Modell, das sich leicht mit dem Morpholino-Knockdown und der Verfügbarkeit effizienter Transgene und gezielter Genmutationen unter Verwendung von CRISPR8 auszeichnet. Quantitative Massenspektrometrie und Einzelzell-Transkriptomik wurden erfolgreich auf Xenopus-Embryonen angewendet9,10, aber ein aktueller Zellatlas von Xenopus laevis zeigt, dass die Zusammensetzung der meisten Gewebe von Blutzelltypen dominiert wird 11. Durch die Entwicklung einer Technik, die Gewebe schnell ausblutet, und unter Verwendung von gekühlten Medien wird die Probenfrische durch die Perfusion nur minimal beeinträchtigt. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen, bei denen es darum geht, eine physiologisch ungestörte mRNA- oder Proteinexpression zu profilieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying glass with LED light and stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting fine-pointed forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection pins</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PIN-#3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 22 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>for X. laevis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 25 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>for X. tropicalis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, porcine intestinal mucosa</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>37-505-410MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B09PTX6M2Z</td>
			<td>size will be dependant on the hosing of the pump used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo-Hegar needle holder</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-966</td>
			<td>mosquito forceps are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic liquid pump dosing pump 5&#8211;100 mL/min</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B07PWY4SM6</td>
			<td>any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-112</td>
			<td>optional; for dulling needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen forceps, serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine short insulin syringes, 31 G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD328438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp &#38; powerful side cutter clippers</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B087P191LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective rapid blood perfusion in xenopus

Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.

Nach erfolgreicher Durchblutung sind alle Gewebe (mit Ausnahme der Leber bei pigmentiertem Xenopus) deutlich heller und weniger durchblutet. Die großen Blutgefäße werden weniger auffällig (Abbildung 10), und das Gewebe (mit Ausnahme der Leber) wird nach der Entnahme sauber im Puffer gespült. Während die erfolgreiche Durchführung des Protokolls letztlich nur durch die Qualität der Daten aus exbluteten Gewebeproben bestätigt werden kann, werden in der Tabelle zur Fehlerbehebu...

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Autor im Rampenlicht: Effektive schnelle Blutperfusion bei Xenopus  

Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.

Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Im Mittelpunkt dieses Verfahrens steht die humane Nutzung von Amphibienmodellen in einer Weise, die die Effizienz maximiert. Standardisierungspraktiken können auf Proben angewendet werden, die in der Ursprungskolonie entnommen und aufbewahrt werden, wodurch Biosicherheitsrisiken gemindert und Tiertransportstress vermieden werden. Die Fülle kann schnell abgeschlossen werden, wodurch die Zeit maximiert wird, die für die Entnahme von Gewebeproben zur Verfügung steht, solange sie noch frisch sind.Diese Frische ist besonders wichtig für das proteomische und transkriptomische Profiling. Dieses Protokoll ist detailliert und explizit, so dass es für Personen mit den unterschiedlichsten Hintergründen verwendet werden kann. Dies erleichtert den Austausch von qualitativ hochwertigen Proben zwischen Xenopus-Laboren.Neben dieser Schmelztechnik wird an einem ähnlich umfassenden Protokoll für die standardisierte Probenahme aller wichtigen Organe gearbeitet.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

4.2K Aufrufe.  Harvard Medical School. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens steht die humane Nutzung von Amphibienmodellen in einer Weise, die die Effizienz maximiert. Standardisierungspraktiken können auf Proben angewendet werden, die in der Ursprungskolonie entnommen und aufbewahrt werden, wodurch Biosicherheitsrisiken gemindert und Tiertransportstress vermieden werden. Die Fülle kann schnell abgeschlossen werden, wodurch die Zeit maximiert wird, die für die Entnahme von Gewebeproben zur Verfügung steht, solange sie noch frisch ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Effektive schnelle Blutperfusion bei Xenopus  

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.