Diese Methode kann nützlich sein, um wichtige Fragen in neurobiologischen Bereichen zu beantworten, wie z. B. wie präsynaptische Terminals in vivo funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass wir kostenlose Ansätze zeigen, um die Funktion von Geruchswegen mit Xenopus Kaulquappen als Tiermodell zu beanstanden. Diese Prozedur werde ich, Beatrice Terni und Paolo Pacciolla, demonstrieren.
Beginnen Sie das Transektionsverfahren, indem Sie zwei Stücke von cellulosequalitativem Filterpapier in 0,02%MS2 22 Anästhesielösung benetzen und unter den Sezierbereich stellen. Dann eine Kaulquappe aus dem Tank holen und in eine Schale mit Anästhesieein eintauchen. Die Kaulquappe sollte innerhalb von zwei bis vier Minuten aufhören zu schwimmen.
Überprüfen Sie die richtige Betäubung durch das Fehlen einer Reaktion auf mechanische Reize, die auf der Schwanzebene mit einer Pinzette angewendet werden. Legen Sie die anästhesierte Kaulquappe auf das Filterpapier unter den Rahmen. Positionieren Sie das Tier mit seiner Rückenseite nach oben, damit Hirnstrukturen visualisiert werden können.
Für Verhaltensexperimente verwenden Sie Veni-Schere, um beide Nerven zu transsektieren, um alle Geruchsinformationen zu unterdrücken, die in die Riechbirne gelangen. Eine Polglaspipette mit zwei Mikrolitern Calciumgrün eine Dextrine Lösung einundsanlegen und in den Mikroinjektor legen. Legen Sie einen anästhesierten Kaulauf unter das Sezieren des Mikroskops auf Filterpapier, bewegen Sie dann die Spitze der Pipette in die Haupthöhle der Nasenkapsel und liefern Sie 0,15 bis 0,3 Mikroliter des Farbstoffs.
Lassen Sie die Kaulquappe für zwei bis drei Minuten an Ort und Stelle. Mit einer Pasteur-Pipette, tropfen 0,02%MS2 22 Lösung auf die mehr Kabeljau Teile des Tieres, um das Trocknen zu vermeiden. Übertragen Sie das Tier in den Bergungstank, wo die Kaulquappe das normale Schwimmen innerhalb von 10 Minuten oder so wiederherstellen sollte.
Beobachten Sie die Blütenstand auf der Ebene der glomerulären Schicht der Olfaktorbirne am Tag nach der Injektion. Bereiten Sie eine anästhesierte Kaulquappe für die Bildgebung vor, indem Sie zuerst die Haut über der Olfaktor-Lampe entfernen. Verwenden Sie Veni-Schere, um einen seitlichen Schnitt auf der Haut der Kaulquappe am Rand des zentralen Nervensystems auf der Ebene der Olfaktor-Lampe zu machen.
Vermeiden Sie es, den Schnitt auf das Tectum auszudehnen, das leicht an der Position des Sehnervs identifiziert werden kann. Halten Sie das Tier feucht, indem Sie Tropfen von 0.02%MS2 22 Lösung mit einer Pasteur Pipette dann kneifen Sie die geschnittene Haut mit einer Pinzette und ziehen Sie es über das Nervensystem. Überprüfen Sie die erfolgreiche Entfernung durch das Fehlen von Melanozyten über der Olfaktor-Glühbirne.
Legen Sie die Kaulquappe in den Brunnen der zellschutzbeschichteten Schale. Positionieren Sie einen mit Hochvakuumfett beschichteten Glasdeckel, um die Oberseite des Tectums bis zum Ende des Schwanzes zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Olfaktor-Lampe und die Placodes dem extrazellulären Medium ausgesetzt bleiben.
Füllen Sie die Pitrischale mit xenopus Ringers Lösung, die 100 Mikromolar-Tubocurarine enthält, um Muskelkontraktionen zu verhindern. Legen Sie die Schale, die die Kaulquappe unter einem aufrechten Mikroskop hält. Verbinden Sie das Reservoir, das die Lösung von Xenopus Ringer enthält, mit der Schale mit Polyethylenschläuchen, um die Lösung von Xenopus Ringer kontinuierlich zu überpromitben.
Beginnen Sie mit der Lösung von Xenopus Ringer. Halten Sie das Niveau der Lösung in der Schale konstant während des gesamten Experiments. Kontinuierliche Bewertung der Kaulquappenlebensfähigkeit durch Beobachtung der Durchblutung durch die Gefäße.
Beginnen Sie die Live-Bildgebung mit einem Ziel mit geringer Vergrößerung, um die Kaulquappe zu visualisieren. Bewegen Sie die Mikromanipulatorachse, um die Kapillare, die die Geruchslösung liefert, auf der Oberseite einer Nasenkapsel zu platzieren, wodurch ein 90-Grad-Winkel mit dem Riechnerv entsteht. Finden Sie die Olfaktor-Lampe ipsilaterally an der Nasenkapsel.
Wechseln Sie zu einem Hochvergrößerungswasserobjektiv mit einem langen Arbeitsabstand. Überprüfen Sie die Blütenstandemission von I.Glomerular Strukturen sollte offensichtlich sein. Beginnen Sie mit der Pipettierung von 20 Millilitern frischer Aminosäurelösung in ein erhöhtes Reservoir.
Dann nehmen Sie sechs Lebensmittel beraubt Kaulquappen aus ihrem Gehäusetank, und legen Sie sie in zwei Liter saubere kauquappen Wasser, um die Exposition gegenüber Geruchsstoffen zu minimieren. Legen Sie eine modifizierte sechs Brunnenschale auf einen weißen LED-Transilluminator. Füllen Sie jeden Brunnen mit 10 Milliliter Kaulquappenwasser.
Legen Sie eine Kaulquappe pro Brunnen, dann lassen Sie für mindestens drei Minuten ruhen. Starten Sie die Bildaufnahme und erfassen Sie Filme, die Basal-, Stimulus- und Erholungsphasen enthalten. Eine attraktive Reaktion kann als Bewegung in Richtung der Düse erkannt werden, die die Lösung von Aminosäuren liefert.
Bringen Sie die Tiere nach der Bildgebung in ihren Tank zurück. Die Verfolgung von Kaulquappenkopfpositionen innerhalb einer Fläche von 35 Millimetern x 35 Millimetern oder der entsprechenden Größe in Pixeln ermöglicht eine quantitative Analyse des geruchsgeführten Verhaltens. Die gepunktete Linie stellt den proximalen Bereich zum Geruchslösungseinlass dar.
Einzelne Plots von Kaulquappenbewegungen werden mit X-Y-Koordinaten erstellt, die durch Bildanalyse erhalten werden. Die extrahierten Motilitätsdiagramme müssen Videobilder originalgetreu wiedergeben. Ein Bereich von Interesse von 8,75 Millimeter Radius zentriert auf den Lösungseinlass wird verwendet, um die Nähe der Tiere zur Geruchsquelle zu klassifizieren.
Mehr Zeit in der Nähe der Düstdüse des Geruchs deutet auf einen positiven Tropismus hin. Die Zeit, die Von Kaulquappen in der Nähe der Düse während definierter Zeiträume verbracht wird, z. B. 15 Sekunden intervallig, ermöglicht die Identifizierung der Fähigkeit, Aminosäurelösungen zu erkennen. Das Gesamtverhalten einer Population von Kaulquappen kann durch die Darstellung der Verteilung einzelner Daten ermittelt werden.
Positiver Tropismus kann nachgewiesen werden, wenn die Aminosäurelösung mit einem Millimolar oder 160 Mikromolar hergestellt wird. Tiere reagieren nicht auf Wasseranwendung. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie histologische Techniken oder Elektrophysiologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Veränderung der synaptischen Eigenschaften nach Verletzungen zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiologie, um die Verarbeitung von olfaktorischen Informationen in Xenopus Kaulquappen zu erforschen.
