Eine erfolgreiche Anwendung dieser Techniken ermöglicht die kinetische Auswertung pharmakologischer Studien oder den Durchgang xenobiotischer Verunreinigungen durch eine morphologisch intakte Plazenta. Die Nagetier-Plazenta-Perfusionstechnik ermöglicht einen höheren Durchsatz pharmakologischer oder toxikologischer Studien, da mehrere Verbindungen mit dem Gewebe eines einzelnen Damms beurteilt werden können. Demonstriert wird die Technik von Jeanine D'Errico, einer Älteren Studentin aus meinem Labor.
Vor Beginn des Verfahrens alle Kammern, Nadeln, Glasmikropipetten, Schläuche und Reservoirs vorsichtig mit erwärmter physiologischer Salzlösung oder PSS füllen und bei Bedarf alle Luftblasen sorgfältig mit einer fein gekippten Transferpipette entfernen. Drehen Sie alle drei Wege-Stoppcocks in die Aus-Position, um die Flüssigkeit in den Pipetten zu sichern. Legen Sie eine einzige Krawatte auf jede der beiden Glasmikropipetten für die Gebärmutterkannulation und auf die beiden stumpfen Spitzennadeln für Nabelkannulation bestimmt.
Dann sichern Sie die Krawatten, um Verlust während der Kammerbewegungen zu verhindern. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesisierten Schwangerschaftstag 20 weibliche schwangere Ratte, heben Sie ein Gebärmutterhorn aus dem Bauch und verbreiten das Horn weit, außerhalb des Tieres. Verwenden Sie geflochtene Seidennähte, um die Gebärmutterarterie an den vaginalen und eierrischen Enden des Horns zu binden, einschließlich des Eierstocks in der Naht mit dem Gebärmutterhorn.
Mit chirurgischen Schere, machen Schnitte auf der proximalen Seite der Eierstock krawatte und die distale Seite der vaginalen Krawatte. Übertragen Sie das Uterushorn in eine mit Silikonkautschuk ausgekleidete und mit kaltem PSS gefüllte Sezschale. Mit der Eierstockseite nach links und der vaginalen Seite nach rechts, drücken Sie vorsichtig einen sezierenden Stift durch das Gebärmutterhorn in den Silikonkautschuk, um die Gebärmutter zu stabilisieren.
Wählen Sie eine mütterliche Plazenta fetale Einheit zentral zum Horn. Entfernen Sie mit feinen Zangen und Scheren die Fruchtwassermembran von der fetalen Oberfläche der Plazenta, wobei Sie darauf achten, die Nabelschnur zu vermeiden. Entwirren und ligaren Die Nabelschnur, um den fetalen Welpen zu trennen.
Nach der Identifizierung der Nabelarterie und Vene, sanft trennen und ligate die Nabelgefäße. Dann schneiden Sie die Nabelvene leicht kürzer als die Nabelarterie für eine einfache Identifizierung. Und ligate die Gebärmutterarterie und Vene mit chirurgischer Schere.
Unter Beibehaltung der korrekten Ausrichtung des anatomischen Blutflusses der Gebärmutterarterie legen Sie die Plazentaeinheit in die modifizierte isolierte Gefäßkammer, die mit warmsauerstoffhaltigem PSS gefüllt ist, unter ein sezierendes Mikroskop. Mit einem Paar feiner Zangen in jeder Hand können Sie die proximalen und distalen Enden der Gebärmutterarterie auf die Glasmikropipetten auffüllen. Sichern Sie die Arterie mit der zuvor platzierten sterilen Nylonnaht fest.
Kanülieren und sichern Sie die Nabelarterie auf der 23 Gauge stumpfnadel. Dann können sie die Nabelvene auf die 25 Gauge stumpfe Nadel und füllen Sie alle Stoppschnepfe und Rohre zu verhindern, Luftblasen zu sichern. Denken Sie daran, alle Stoppschnepfe, Kanülen und Schläuche auf Luftblasen zu überprüfen, da ein Luftbolus im System zu zellulärer Not führt und den Gegenstromfluss innerhalb der Plazenta eliminiert.
Schließen Sie alle Schläuche entsprechend der Abbildung an. Legen Sie kleine Wägeboote unter die distale Cannulation der mütterlichen Gebärmutterarterie und unter die Nadelkanüle der fetalen Nabelvene, um die Abwässer zu fangen, die im Laufe des Eingriffs entstehen. Bereiten Sie die Sammelplatte für das Abwasser für die spätere Analyse vor.
Öffnen Sie den Stopphahn, um den Flüssigkeitsfluss durch die Schläuche in Richtung der Plazenta zu ermöglichen, und schalten Sie die Peristaltikpumpe, druckregelung und den Druckmonitor ein. Erhöhen Sie den Druck langsam auf 80 Millimeter Quecksilber, das auf dem Druckmonitor abgelesen wird. Öffnen Sie langsam den Stopphahn, um den Flüssigkeitsfluss zur Gebärmutterarterie zu ermöglichen.
Füllen Sie alle Reservoirs, um das Flüssigkeitsvolumen während des gesamten Experiments zu erhalten. Nachdem sich die Gewebe 30 Minuten lang ausgeglichen haben, damit sich die Gefäße an den neuen Flüssigkeitsfluss anpassen können, stellen Sie die Ausgangsdurchblutung fest, indem Sie abfließende Stoffe für 10 Minuten von beiden Wägebooten sammeln. Messen Sie das Volumen der Flüssigkeit, die durch die Gebärmutterarterie und Nabelvene entsteht.
Am Ende des Basissammelzeitraums die experimentelle Behandlung in die Gebärmutterarterie. Dann sammeln Sie Proben aus der distalen Gebärmutterarterie und fetalen Nabelvenenabwässern alle 10 Minuten für insgesamt 180 Minuten nach der Infusion. Messen Sie die Verunreinigungen in den Flüssigkeitsproben.
Perfusion mit Evans blauer Farbstoff, um das System zu testen und die geeignete Flüssigkeits- und Plazentabarrierefunktion zur Verhinderung der Kontamination in das fetale Fach zu visualisieren, zeigt, dass der Farbstoff das Plazentagewebe in diesem System erreichte und durchsetzte. Bei näherer Untersuchung wird klar, dass der blaue Farbstoff Evans nicht in die fetale Nabelvene gelangte, was erwartet wird, da der Blaue Farbstoff Evans an Albumin gebunden ist. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine reduzierte Flüssigkeitsübertragung in das fetale Fach innerhalb von 10 Minuten nach Polystyrolinfusion identifiziert.
Der Polystyroltransfer indas fetale Fach erreichte dann einen Höchststand von 20 Minuten und dauerte 90 Minuten. Das Wichtigste, was man sich während der Cannulation merken sollte, ist, langsam zu gehen. Die Pipetten und das Gewebe sind sehr empfindlich und können leicht gebrochen oder gerissen werden.
Durch Abwägung der Auswirkung könnte diese Methode zur Untersuchung der Plazentaphysiologie sowie der Materialtranslokation verwendet werden.
