Questo lavoro è stato supportato dal OD031956 di sovvenzione OD R24 del NIH e dal HD073104 della sovvenzione NICHD R01. Ringraziamo Darcy Kelly per le utili discussioni e gli input iniziali su questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan per la loro assistenza e supporto, nonché i nostri tre revisori anonimi per il loro feedback.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association12, non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco13. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un metodo umano ed efficace per l'eutanasia di successo12. Poiché mantenere i tessuti freschi attraverso l'eutanasia è l'obiettivo di questo protocollo, è utile che il cuore continui a battere attraverso l'eutanasia primaria con MS-222 e che la perfusione sia essa stessa un metodo di eutanasia secondario attraverso il dissanguamento.
1. Preparazione
<ol><li>Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia e perfusione descritta in questo protocollo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 g/L MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio. Il volume dovrebbe essere maggiore del volume richiesto per coprire completamente gli animali sottoposti a eutanasia. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.</li>
	<li>Preparare 500 μL di 180 U/mL di eparina in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per X. laevis o 200 μL per X. tropicalis.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia primaria ponendo lo Xenopus in questa soluzione (dal punto 1.2); L'animale rimarrà sommerso per un totale di 1 ora.</li>
	<li>Conferma che lo Xenopus ha perso la sua risposta al dolore pizzicando il piede 15 minuti nell'eutanasia. Se l'animale è reattivo, riportarlo alla soluzione di eutanasia fino a quando questa risposta non viene persa.</li>
	<li>Pesare lo Xenopus ed effettuare eventuali misurazioni aggiuntive necessarie prima del campionamento.</li>
	<li>Utilizzando un ago da 31 G, iniettare X. laevis con 250 μL e X. tropicalis con 100 μL di 180 U/mL di eparina in PBS (dal punto 1.3) nella muscolatura di ciascun arto anteriore.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1 mL/g del peso animale di 54 U/mL di eparina in PBS perfufato. Gli individui più esperti con questo protocollo possono scoprire che è necessario meno media per completare la perfusione.</li>
	<li>Utilizzare un ago ipodermico da 22 G per perfondere X. laevis e un ago ipodermico da 25 G per X. tropicali s. Smussare l'ago di perfusione tagliando la punta con tronchesi (Figura 1)14. NOTA: Questo riduce la probabilità che l'ago penetri attraverso il ventricolo se spostato. Oltre a smussare, l'ago può essere leggermente macinato con una pietra o una lima affilante, ma rimanendo comunque abbastanza affilato da perforare il ventricolo.</li>
	<li>Preparare la pompa attaccando l'ago tagliato e facendo circolare 54 U/mL di perfusato di PBS eparinizzato (dal punto 1.8). Assicurarsi di eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo per eliminare la possibilità di embolia d'aria, che porta a una diminuzione dell'efficienza di perfusione o al guasto (vedere Tabella 1). Mantenere il mezzo di perfusione sul ghiaccio per tutta la durata della procedura.</li>
	<li>Se la pompa non è programmabile, con l'ago in posizione, misurare il volume pompato del fluido con le diverse impostazioni per determinare quali impostazioni sono più vicine a 5 mL/min e 10 mL/min. Queste portate saranno utilizzate indipendentemente dalla specie. Se la pompa di perfusione è programmabile, calibrarla con l'ago in posizione, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Posizionare la superficie di dissezione (vassoio o foglio di schiuma) su un'inclinazione all'interno di un contenitore secondario o disporla per facilitare il drenaggio del sangue.</li>
	<li>Una volta che la rana è stata nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e ricontrollare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzico del piede.</li>
	<li>Posizionare la rana sul dorso e fissare ogni arto (Figura 2). Se è necessario preservare il tessuto degli arti, è possibile posizionare spilli sottili attraverso le dita o graffette a forma di U intorno agli arti.</li>
	<li>Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi. (Figura 2)</li>
	<li>Utilizzare una pinza per afferrare la linea alba e allontanarla dalla cavità celomica (Figura 3). Usa con attenzione le forbici per tagliare la muscolatura. Fai due lembi fuori dalla parete della cavità e taglia o appunta tutti i lembi fuori strada.</li>
	<li>Utilizzare le forbici da dissezione per tagliare le ossa coracoidi e tagliare via il tessuto in eccesso per ottenere un migliore accesso al cuore (Figura 3).</li>
	<li>Il cuore dovrebbe ancora battere. Se il cuore ha smesso di battere prima della perfusione, notare che la freschezza del campione è stata compromessa.</li>
</ol>2. Perfusione
<ol><li>Identificare lo stomaco e spostarlo delicatamente in modo che sia sopra il lobo sinistro del fegato (alla destra dello spettatore), con la sua vascolarizzazione visibile per tutta la durata della procedura. Identificare un polmone e afferrarlo per la punta usando una pinza tissutale. Tirare il polmone all'esterno della cavità celomica e fissarlo attraverso la punta (Figura 4). Fallo delicatamente, poiché i vasi sanguigni rotti non si fondono bene. Nota se il sangue è visibile all'interno del lobo, in quanto ciò influenzerà la capacità di determinare il completamento della procedura.</li>
	<li>Prendere un'immagine della cavità celomica per valutare meglio l'efficienza della perfusione e potenzialmente identificare i tessuti anomali in un secondo momento.</li>
	<li>Identificare il pericardio sottile e tirarlo insegnato con una pinza tissutale (Figura 5). Perforare delicatamente il pericardio usando la punta delle forbici per iridectomia, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle tre camere del cuore.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente il ventricolo dal suo apice. Applicare una pressione limitata in modo che vi sia spazio sufficiente tra le superfici di trazione della pinza per il passaggio dell'ago di perfusione (Figura 6).</li>
	<li>Inserire l'ago attraverso la chiusura della pinza nella camera del ventricolo, facendo attenzione a non perforare attraverso il ventricolo (Figura 7). Bloccare la pinza tissutale in posizione utilizzando un supporto per aghi utilizzando un emostato. NOTA: Questa tecnica stabilizza la posizione dell'ago, che è ancora affilato. Anche il serraggio dell'ago direttamente al ventricolo causerà danni inutili, rendendo più difficile il riserraggio in caso di necessità (vedere Tabella 1).</li>
	<li>Avviare il flusso della pompa a circa 5 ml/min. Le tre camere del cuore e del tronco arterioso si ingorgeranno (Figura 8; vedi Tabella 1).</li>
	<li>Con le forbici, lanciare con attenzione il padiglione auricolare destro (alla sinistra dello spettatore); Il sangue si riverserà. Impostare la portata a 5 ml/min o aumentarla a 10 ml/min.</li>
	<li>Continuare fino a quando la vascolarizzazione dello stomaco sbianca (vedi Tabella 1), quindi lanciare il padiglione auricolare sinistro del cuore (alla destra dello spettatore). Se la portata è ancora di 5 ml/min, aumentarla a circa 10 ml/min.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di trasferimento per sciacquare la cavità celomica nei mezzi di perfusione, per aiutare a mantenere la visibilità e per valutare meglio il colore del perfusato che scorre dai padiglioni auricolari.</li>
	<li>Tenere l'ago in posizione fino a quando il perfusato che scorre dai padiglioni auricolari è chiaro (vedere Tabella 1) e il polmone ha perso la sua tonalità rossa (vedere Tabella 1; Figura 9).</li>
</ol>

Perfusione sanguigna nelle rane artigliate africane per trascrittomica e proteomica

<ol>
	<li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum.">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog,+Xenopus+laevis+(Daudin):+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li><li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis+Daudin:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li><li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li><li>Miodo&#324;ski, A. J., B&#228;r, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+(Rana+temporaria,+Rana+esculenta).+Scanning+electron-microscopic+(SEM)+study+of+microcorrosion+casts.">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li><li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease.">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis.">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution.">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution.">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).</li><li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals,+2020+edition.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , 37 (2020).</li><li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+(Xenopus+laevis).">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America.">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li><li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vertebrate+heart:+an+evolutionary+perspective.">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li><li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+protocol+for+lizards,+including+a+method+for+brain+removal.">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.
Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati pos...

La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per animale per X. tropicalis e meno di 15 minuti per X. laevis animale. Le priorità secondarie sono la facilità di replica e l'uso di apparecchiature facilmente acquisibili in modo che i campioni di alta qualità possano essere ampiamente condivisi tra i laboratori Xenopus.
Le rane Xenopus sono ampiamente utilizzate nella ricerca biomedica per studiare i processi biologici e patologici fondamentali conservati tra le specie. Questo tetrapode ha una relazione evolutiva più stretta con i mammiferi rispetto ad altri modelli acquatici, avendo polmoni, un cuore a tre camere e arti con dita. La comunità internazionale utilizza efficacemente Xenopus per ottenere una comprensione più profonda delle malattie umane attraverso modelli approfonditi della malattia e analisi molecolare della funzione genica correlata alla malattia. I numerosi vantaggi di Xenopus come modello animale li rendono strumenti inestimabili per studiare le basi molecolari dello sviluppo umano e delle malattie; Questi vantaggi includono: grandi dimensioni di ovociti ed embrioni, alta fecondità, facilità di alloggiamento, rapido sviluppo esterno e facilità di manipolazione genomica. È stato stimato che Xenopus condivida ~ 80% dei geni della malattia umana identificati7.
Rispetto ai modelli di mammiferi popolari, Xenopus è un modello rapido ed economico, con la facilità di abbattimento del morfolino e la disponibilità di transgenici efficienti e mutazioni genetiche mirate utilizzando CRISPR8. La spettrometria di massa quantitativa e la trascrittomica monocellulare sono state applicate con successo agli embrioni di Xenopus9,10, ma un recente atlante cellulare di Xenopus laevis mostra che la composizione della maggior parte dei tessuti è dominata dai tipi di cellule del sangue 11. Sviluppando una tecnica che dissangua il tessuto a un ritmo rapido e utilizzando mezzi refrigerati, la freschezza del campione è minimamente influenzata dalla perfusione. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni in cui l'obiettivo è quello di profilare l'espressione fisiologicamente imperturbata di mRNA o proteine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying glass with LED light and stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting fine-pointed forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection pins</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PIN-#3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 22 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>for X. laevis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 25 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>for X. tropicalis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, porcine intestinal mucosa</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>37-505-410MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B09PTX6M2Z</td>
			<td>size will be dependant on the hosing of the pump used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo-Hegar needle holder</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-966</td>
			<td>mosquito forceps are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic liquid pump dosing pump 5&#8211;100 mL/min</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B07PWY4SM6</td>
			<td>any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-112</td>
			<td>optional; for dulling needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen forceps, serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine short insulin syringes, 31 G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD328438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp &#38; powerful side cutter clippers</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B087P191LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective rapid blood perfusion in xenopus

Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.

Dopo una perfusione riuscita, tutti i tessuti (escluso il fegato in Xenopus pigmentato) saranno nettamente più leggeri e meno saturi di sangue. I principali vasi sanguigni diventeranno meno evidenti (Figura 10) e i tessuti (escluso il fegato) risciacqueranno in modo pulito nel tampone dopo essere stati campionati. Mentre la corretta esecuzione del protocollo può essere confermata solo dalla qualità dei dati provenienti da campioni di tessuto dissanguato, diversi problemi tipici, ...

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Autore in primo piano: Perfusione sanguigna rapida efficace in Xenopus  

Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Questa procedura è incentrata sull'utilizzo umano dei modelli di anfibi in modo da massimizzare l'efficienza. Le pratiche di standardizzazione possono essere applicate ai campioni prelevati e conservati presso la colonia di origine, mitigando i rischi di biosicurezza ed eliminando lo stress da trasporto degli animali. La profusione può essere completata rapidamente, massimizzando il tempo disponibile per campionare i tessuti mentre sono ancora freschi.Questa freschezza è particolarmente importante per la profilazione proteomica e trascrittomica. Questo protocollo è dettagliato ed esplicito, rendendolo utilizzabile per le persone con un'ampia varietà di background. Ciò facilita la condivisione di campioni di alta qualità tra i laboratori Xenopus.Insieme a questa tecnica di profusione, si sta lavorando a un protocollo altrettanto completo per il campionamento standardizzato di tutti i principali organi.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

4.2K Views.  Harvard Medical School. Questa procedura è incentrata sull'utilizzo umano dei modelli di anfibi in modo da massimizzare l'efficienza. Le pratiche di standardizzazione possono essere applicate ai campioni prelevati e conservati presso la colonia di origine, mitigando i rischi di biosicurezza ed eliminando lo stress da trasporto degli animali. La profusione può essere completata rapidamente, massimizzando il tempo disponibile per campionare i tessuti mentre sono ancora freschi.Questa freschezza è particolarm...

Video: Autore in primo piano: Perfusione sanguigna rapida efficace in Xenopus  

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...