Diese Arbeit wurde durch das Hubei Key Laboratories Opening Project (Zuschussnummer 2021KFY055), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Hubei (Zuschussnummer 2020CFB240) und den Fonds für Grundlagenforschung für die zentralen Universitäten (Zuschussnummer 2042020kf0065) finanziert.

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle verwendeten C57BL/6J-Mäuse stammen aus dem Versuchstierzentrum der Universität Wuhan, und alle damit verbundenen Experimente wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Universität Wuhan genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Mäuse zu minimieren.
1. Enukleation und Fixierung der Augen
<ol><li>Einschläfern Sie die Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung ein und entkernen Sie den Augapfel sanft mit einer zahnlosen Pinzette.</li>
	<li>Spülen Sie den Augapfel einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.</li>
	<li>Punktieren Sie den Augapfel mit einer Spritzennadel an der Hornhaut unter dem Mikroskop (Okular WF: 10x/22; kontinuierliches Vergrößerungsobjektiv: 0,67x-4,5x), um die Fixierung in den Augapfel zu beschleunigen und die Fixiereffizienz zu verbessern.</li>
	<li>Transfer auf eine 24-Well-Platte mit 4 % Paraformaldehyd (PFA).</li>
	<li>Fixieren Sie den Augapfel 45 Minuten lang in 4% PFA und übertragen Sie ihn dann auf 1x PBS, um überschüssiges PFA (dreimal waschen, 5 min/Zeit) sofort zu entfernen.</li>
</ol>2. Isolierung und Abflachung der Netzhaut
<ol><li>Übertragen Sie den Augapfel auf einen Objektträger und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop (Okular WF: 10x/22; Objektiv mit kontinuierlicher Vergrößerung: 0,67x-4,5x).</li>
	<li>Halten Sie die Pinzette in einer Hand und klemmen Sie damit den Rand der Hornhaut ab, um eine Bewegung des Augapfels zu verhindern. Halten Sie die Präparierschere mit der anderen Hand fest und schneiden Sie in ca. 1 mm Tiefe um die Hornhaut herum durch den Hornhaut-Limbus. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper.</li>
	<li>Halten Sie die Papille in der Mitte und schneiden Sie die Netzhaut mit einer Präparierschere radial entlang der vier Quadranten, wobei Sie etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen.</li>
	<li>Klemmen Sie eine der Sklerakanten mit einer gezahnten Pinzette. Halten Sie mit der anderen Hand den Rand der Sklera mit einer unverzahnten Pinzette fest und bewegen Sie sich von der Stelle, an der die Sklera durch die gezahnte Zange fixiert ist, zur Basis der Sklera. Schälen Sie die Netzhaut vorsichtig.</li>
	<li>Ziehen Sie PBS mit einer Pipette (200 μl) ab, um die Netzhaut zu spülen und zu befeuchten, und entfernen Sie dann überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Glätten Sie die Netzhaut bei Bedarf vorsichtig mit einer kleinen Borstenbürste.</li>
	<li>Kaltes Methanol (vorgekühlt in einem −20°C Gefrierschrank) langsam tropfenweise auf die Innenfläche der Netzhaut pipettieren (das Methanolvolumen ist nicht fixiert, solange die Netzhaut vollständig vom Methanol bedeckt werden kann). Die Netzhaut verfärbt sich weiß und entwickelt eine erhöhte Zähigkeit.</li>
	<li>Glätten Sie die Netzhaut sanft und entfernen Sie Verunreinigungen wie Restpigmentmembranen und den Glaskörper mit kleinen Borstenbürsten. Drehen Sie die Netzhaut mit kleinen Borstenbürsten um und wiederholen Sie den oben genannten Vorgang.</li>
	<li>Übertragen Sie die mit Methanol behandelte Netzhaut in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und halten Sie sie in Methanol getränkt.</li>
	<li>Lagern Sie es 1-2 h lang bei −20 °C für eine sofortige Immunfärbung oder lassen Sie die Netzhaut in Methanol und lagern Sie es zur Langzeitlagerung bei −20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Methanol von der 24-Well-Platte und spülen Sie die Netzhaut mit 1x PBS.</li>
</ol>3. Immunfluoreszenzfärbung der RGCs
<ol><li>Übertragen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf eine 24-Well-Hämagglutinationsplatte und blockieren Sie sie in 5 % PBS-TX-BSA (5 g Rinderserumalbuminpulver, gelöst in 100 ml 1x PBST-Lösung; das PBST wird durch Zugabe von 10 ml Triton X-100 zu 2.000 ml 1 x PBS) bei Raumtemperatur für 4 h oder über Nacht bei 4 °C. Halte das Ganglion mit der Seite nach oben.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS-TX-BSA und inkubieren Sie die Netzhaut bei 4 °C für 48-96 h, wobei 100 μl des ausgewählten Primärantikörpers (Meerschweinchen-Anti-RBPMS-Antikörper) in einer Verdünnung von 1:400 hinzugefügt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Netzhaut dreimal (jeweils 20 Minuten) mit 1x PBS unter Schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubation der Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 °C mit 100 μL des entsprechenden Sekundärantikörpers (siehe Materialtabelle), Cyanin Cy3 affiniPure Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L), in einer Verdünnung von 1:400.</li>
	<li>Spülen Sie die Netzhaut dreimal (je 20 min) mit 1x PBS.</li>
	<li>Legen Sie die Netzhaut flach mit der Ganglienzellschicht nach oben auf den Objektträger, tropfen Sie mit einer Pipette eine angemessene Menge Antifluoreszenzlöschmittel um die Netzhaut und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen). Anmerkungen: Um die geeignete Menge an Anti-Fluoreszenz-Quencher zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Netzhaut bedeckt. Decken Sie danach den Objektträger ab, ohne dass die Netzhaut schweben und sich leicht bewegen kann.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Objektträger rundum mit einem Dichtungsmittel, um ein Verrutschen zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei −20 °C und schützen Sie sie vor Licht.</li>
	<li>Stellen Sie die Netzhaut mit einem Fluoreszenz-/Konfokalmikroskop dar.</li>
</ol>

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry.">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li><li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives.">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li><li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images:+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling.">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li><li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

Den Autoren sind keine Zugehörigkeiten, Mitgliedschaften, Finanzierungen oder finanziellen Beteiligungen bekannt, die die Objektivität dieser Studie beeinträchtigen könnten.

Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allei...

Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn1. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet 2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten 4,5.
Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay ist eine weithin anerkannte Methode zur Überwachung der Verteilung von Proteinen und der Zellzählung. Im Labor wird die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut häufig in experimentellen Studien an RGCs verwendet, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten6. Zu den gebräuchlichsten Markern, die für die RGC-Quantifizierung in der gesamten Netzhaut verwendet werden, gehören Brn3a, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) usw. 7,8. Die Charakterisierung der Menge und Verteilung von RGCs erfordert eine qualitativ hochwertige Immunfärbung der gesamten Netzhaut. Im Allgemeinen wird die Netzhaut bei Immunfärbeprotokollen in chemische Fixiermittel getaucht, bevor sie in Antikörpern inkubiert wird. Ideale Fixiermittel sollten die Form der Zellen, die Zugänglichkeit oder Affinität der Epitope für Antikörper oder die linearen Abmessungen des Gewebes nicht verändern 9,10.
Aufgrund der komplexen Struktur der Netzhaut treten bei der Herstellung eines Whole-Mount-Netzhautpflasters häufig Probleme wie Fragilität und Faltung der Netzhaut sowie einige häufige Schwierigkeiten wie Zellschrumpfung und unklare Zellkerne auf, was sich negativ auf die experimentelle Forschung auswirkt. Darüber hinaus werden nicht alle Netzhäute sofort immungefärbt, insbesondere wenn es sich um die Netzhaut von transgenen Mäusen handelt, die zu teuren Preisen wertvoller Herkunft sind, was die Konservierung der zusätzlichen Netzhautproben für die weitere Verwendung erforderlich macht.
Die geeignete Fixierlösung kann das Gewebe schnell fixieren, eine Gewebeautolyse vermeiden, die normale Morphologie und Struktur der Gewebezellen erhalten und die Antigenität von Proteinen und anderen Substanzen erhalten10. Gegenwärtig wird die Fixierung auf Formaldehydbasis häufig in verschiedenen Geweben eingesetzt, darunter getrennte Netzhaut, halbgeschnittene Augenmuscheln und ganze Augäpfel10. Die Schrumpfung des Gewebes und die morphologische Veränderung von Zellen sind die beiden entscheidenden Herausforderungen, die nach dem Eintauchen in Formaldehydauftreten 11. Darüber hinaus werden zunehmend modifizierte Fixierungsformulierungen entwickelt, um die Erhaltung der ursprünglichen Eigenschaften der Netzhaut und der Zielzellen zu maximieren 9,10. Verschiedene Netzhautfixationsbehandlungen können die Netzhautstruktur, die Proteinimmunogenität, die Fluoreszenzanregung und den Abschwächungslöschzyklus unterschiedlich beeinflussen12,13. Netzhäute, die mit Davidson-Lösung fixiert wurden, sind morphologisch intakter als solche, die mit Formalin fixiert wurden, aber Davidsons Lösung ist weniger kompatibel mit einigen Antikörpern, wie z. B. dem Mikroglia-Marker-ionisierten Kalzium-bindenden Adaptermolekül 112. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut würden sich die Forscher natürlich fragen, ob sich die Integrität der Netzhaut sowie die Eigenschaften und die Morphologie der Zielzellen nach längerer Lagerung verändern werden. Über die möglichen Auswirkungen der Fixierlösung auf die Morphologie der Netzhaut und der RGC-Zellen nach mehrmonatiger Lagerung wurde jedoch nur selten berichtet. Die Optimierung der Netzhautfixierung ist entscheidend für die Beurteilung und Erhaltung von RGCs.
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode, die wir für die Total-Mount-Färbung der murinen Netzhaut verwenden. Unsere Methode legt den Schwerpunkt auf die richtige Präparation und Lagerung von Netzhäuten für die RGC-Untersuchung, wobei die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhautgewebe sowie spezifische Aspekte der Fluorophorbildung oder des Fluorophorabbaus berücksichtigt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.

Nach der Präparation sollte die Netzhaut wie ein flaches vierblättriges Kleeblatt aussehen. In dieser Studie wurde die Netzhaut nach der Zugabe von Methanol nach Anwendung des oben beschriebenen Protokolls weiß (Abbildung 1). Währenddessen veränderte sich die Netzhaut von weich zu biegsam und flach. Als nächstes wurden die RGCs mit Anti-RBPMS8 gekennzeichnet. Vier Bildfelder wurden in der Whole-Mount-Netzhaut (n = 3) mit einem konfokalen Mikroskop (Okular: 10x; ...

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Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Die Forschung zielt darauf ab, einen modifizierten Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und ein Protokoll zur Lagerung von Gewebeproben bereitzustellen, das für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch ist. Netzhäute sind zerbrechlich und faltbar, was die experimentelle Forschung bei der Herstellung eines gesamten Netzhautpflasters einschränkt. Darüber hinaus benötigen alle Netzhäute keine sofortige Immunfärbung.Manchmal müssen zusätzliche Netzhautproben für die weitere Verwendung aufbewahrt werden. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode zur Whole-Mount-Netzhautfärbung, die die richtige Vorbereitung und die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhaut für die RGC-Untersuchung hervorhebt. Wir werden weiter an der Grundlagenforschung zu degenerativen Optikusneuropathien arbeiten.Darüber hinaus werden die molekularen Mechanismen der Sehnervenverletzung und der Unfallregeneration sowie mögliche klinische Angriffspunkte für die Diagnose und Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen erforscht.

methanol-based-whole-mount-preparation-for-investigation-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

2.9K Aufrufe.  Renmin Hospital of Wuhan University. Die Forschung zielt darauf ab, einen modifizierten Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und ein Protokoll zur Lagerung von Gewebeproben bereitzustellen, das für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch ist. Netzhäute sind zerbrechlich und faltbar, was die experimentelle Forschung bei der Herstellung eines gesamten Netzhautpflasters einschränkt. Darüber hinaus benötigen alle Netzhäute keine sofortige Immunfärbung.Manchmal müssen zusätzliche Netzhautproben für die...

Serie: Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...