Nachdem Sie den enukleierten Augapfel der euthanasierten Maus fixiert haben, übertragen Sie ihn auf einen Glasobjektträger und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop. Klemmen Sie mit einer Pinzette den Rand der Hornhaut ab, um eine Bewegung des Augapfels zu verhindern. Schneiden Sie mit der Präparierschere in einer Tiefe von etwa einem Millimeter um die Hornhaut herum durch den Limbus der Hornhautsklera und entfernen Sie dann die Linse und den Glaskörper.
Halten Sie die Papille in der Mitte und schneiden Sie die Netzhaut radial entlang der vier Quadranten, wobei Sie etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen. Klemmen Sie eine der Sklerakanten mit einer gezahnten Pinzette. Halten Sie die Sklerakante mit einer ungezahnten Pinzette fest und bewegen Sie sich von der gezahnten Pinzette in Richtung Sklerabasis.
Schälen Sie die Netzhaut vorsichtig. Befeuchten Sie die Netzhaut mit einer Pipette mit 200 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit saugfähigem Papier und glätten Sie die Netzhaut bei Bedarf mit einer kleinen Borstenbürste.
Geben Sie kaltes Methanol langsam tröpfchenweise auf die Innenseite der Netzhaut, bis sie vollständig bedeckt ist. Sobald sich die Netzhaut weiß verfärbt und eine erhöhte Zähigkeit entwickelt, glätten Sie die Netzhaut sanft und entfernen Sie Verunreinigungen wie Restpigmentmembranen und den Glaskörper mit einer kleinen Borstenbürste. Nachdem Sie die Netzhaut invertiert haben, behandeln Sie sie wie zuvor gezeigt mit Methanol und übertragen Sie sie in eine Vertiefung mit 24 Wells, weichen Sie sie in Methanol ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden zur sofortigen Immunfärbung.
Spülen Sie dann die Netzhaut mit PBS, nachdem Sie Methanol von der Platte entfernt haben. Die Retinol-Ganglienzellen der Netzhaut vor und nach der Methanolbehandlung wurden mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht, was darauf hindeutete, dass die 12-monatige Methanolkonservierung keinen Einfluss auf die RGC-Immunfärbung hatte.
