Das beschriebene Projekt wurde von Grant Number R01HD050725 vom National Institute of Child Health and Human Development unterstützt, um TAG Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Child Health and Human Development oder die National Institutes of Health. Wir danken Mitglieder der Godenschwege Labor sowie Barbara Schreader für ihren Input, um das Manuskript und Video.

1. Präparation des Bauchmark Dissection und Farbstoff Füllung des GF kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Für alle Dissektion Schritte kaltem (4 ° C) Kochsalzlösung verwendet zu verlangsamen Zellstoffwechsel und halten Sie die Neuronen länger am Leben sein. <ol><li> Anesthetize erwachsenen Fliegen (4 Tage oder älter) mit CO 2 oder Chill sie auf Eis, bis sie immobilisiert sind. Betäubende mit Eis erfordert mehr Zeit (bis zu 30 min) wird aber die Fliegen länger immobilisiert halten. </li><li> Legen Sie eine Fliege in einem Sylgard beschichtete Petrischale. Diese Zerlegung erfordert den Einsatz von hoher Vergrößerung (80-100X) Dissektion Stereomikroskop. </li><li> Mit Vannas Schere, zu entfernen Beine, Rüssel und Flügel. </li><li> Verwenden Sie groben und feinen Pinzette Insektennadeln (minutien Pins) zu orientieren the fly Dorsalseite in der Sylgard Gericht. Pin den Bauch und dann verlängern das Tier leicht, indem man zwei Pins auf jeder Seite des Halses, hinter dem Kopf, so dass der Hals etwas gestreckt und zugänglich (siehe Abbildung 2). </li><li> Tauchen Sie die fliegen in frischem, kaltem Drosophila Kochsalzlösung. Die am häufigsten verwendeten Drosophila Salinen sind ausreichend für die Präparation, aber hier haben wir eine Kochsalzlösung in Gu und O&#39;Dowd beschrieben, 2006 4 verwendet. Eine Luftblase wird Surround-the-fly. Entfernen Sie die Luft mit einer Spritze. </li><li> Machen Sie eine kurze, seitliche Einschnitt in das dorsale Ende des Bauches. Ab dem Einschnitt, einen flachen, geraden Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie des Bauches auf den Brustkorb. Dann weiter die flache, längs geschnitten in den Brustkorb so genau wie möglich entlang der Mittellinie in Richtung der Binde. Es ist entscheidend, um die Schnitte flach, um nicht zu Schäden am VNC (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie zwei schöne Insekten Pins vorsichtig öffnen den Brustkorb. Verbreiten Sie die Gehäusehälften auseinander mit den Stiften ab und stecken die Stifte durch die Flugmuskulatur (Abbildung 2). Der Brustkorb sollte nicht weiter geöffnet werden, wie in der Abbildung 2 zu vermeiden, Rippen der Kutikula dargestellt. Um eine gerade Ausrichtung der VNC die Stifte sollten in der gleichen vorderen hinteren Position auf jeder Seite platziert werden. </li><li> Der Zugang zu den VNC für Farbstoff-Einspritzung und korrekte Bildgebung kann durch inneren Organe behindert werden. Verwenden Sie daher Pinzette und Schere, um den Magen, Darm, Herz und Fortpflanzungsorgane zu entfernen. Ziehen Sie die Speicheldrüsen liegen auf beiden Seiten des VNC. Spülen Sie die Dissektion sorgfältig mit frischen Kochsalzlösung zu schweben und Fettgewebe zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die fetten Körper unterhalb der zervikalen Bindegewebe (CVC). Der Fettkörper ist am besten sichtbar bei hoher Vergrößerung. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig fassen das Gewebe von der Seite und ziehen Sie ihn heraus. </li></ol> Die Zerlegung kann innerhalb von 5 bis 10 Minuten durchgeführt werden. Durch die Verwendung von frischem, kaltem Kochsalzlösung der seziert, unbeschädigten Nervensystems bleibt für mindestens eine Stunde am Leben. 2. Intrazelluläre GF füllen Es wird empfohlen, um den Farbstoff zu füllen, sobald wie möglich nach der Präparation durchführen. <ol><li> Legen Sie die Sylgard Schale mit dem seziert fliegen unter einem aufrechten Mikroskop mit einer festen Phase (Abbildung 3) und ein 10x Luft Ziel. Zentrum der Probe mit dem hinteren Ende der Fliege auf den Farbstoff zu füllen Elektrodenhalter positioniert. Verwenden Sie die Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)-Modus und Fokus auf die CVC. Die großen Axone der GF muss deutlich sichtbar auf der dorsalen Oberfläche des CVC. </li><li> Verdünnen Sie Lucifer Yellow CH Dilithiumsalz in deionisiertem H2O zu einer Konzentration von 1%. Ziehen Sie einen Borosilikatglas Elektrode mit Filament zu einem Widerstand von ca.. 60-80 MOhm. Die Spitze der Glaselektrode sollte lang und scharf. Füllen Sie die Spitze der Elektrode mit 1% Lucifer Yellow-Lösung, indem die Elektrode mit dem entgegengesetzten Ende der Elektrodenspitze in die Lucifer Yellow Lösung für ca.. 30-60 Sekunden. Dann Hinterfüllung der Elektrode mit 3M LiCl mit einer Hamilton-Spritze Verlassen einer Luftblase zwischen dem Farbstoff und LiCl. Verbinden Sie den Farbstoff zu füllen Elektrode an den Kopf der Bühne. </li><li> Legen Sie ein Chlorid-beschichteten Silberdraht Masseelektrode in die Kochsalzlösung und Ort der Farbstoff füllen Elektrode über dem fliegen parallel zu den VNC mit einem 3D-hydraulischen Mikromanipulator. Der Farbstoff füllen Elektrode sollte an einen Verstärker, dass die Weitergabe Strom, um negativ oder positiv geladene Farbstoffe Entlassung aus der Elektrode, indem Hyper-oder depolarisierende Strom bzw. ermöglicht angeschlossen werden. </li><li> Wechseln Sie zu einem 40x Wasser Immersionslinse und unteren Spitze des Farbstoffes füllen Elektrode auf einem der GFS. Die GF Axone legen nahe der dorsalen Oberfläche des CVC. Verwenden Sie eine nach vorne (in Richtung des Kopfes) Bewegung an der Elektrode in die GF einzufügen. </li><li> Ändern Sie Ihre Lichtquelle epifluoreszenten Licht und wechseln Sie zu einem Lucifer Yellow-Filter. Tragen Sie eine Hyperpolarisation aktuellen, um den Farbstoff zu füllen Elektrode mit Verstärker zu den Lucifer Yellow in die GF zu injizieren. Die Menge an Farbstoff injiziert werden kann, indem th gesteuert werdene Menge an Strom bestanden sowie die Dauer der aktuellen übergeben wird. Um zu verhindern, der Farbstoff aus Verschütten aus der Injektionsstelle oder Beschädigung der GF, empfiehlt es sich, spritzen mit einem geringen Strom (ca. 3-5 nA) über 1-5 Minuten. </li><li> Bewerben Strom, bis die GF-Terminal in der VNC deutlich zu erkennen ist (Abbildung 4A). Für trans-synaptische Färbung von postsynaptischen Neuronen, weiterhin passieren, bis Farbstoff kann auch in postsynaptischen Neuronen gesehen aktuell sein. Schalten Sie den Strom, und entfernen Sie die Farbe füllen Elektrode. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Ein Vertreter Farbstoff füllen für einen GF mit Lucifer Yellow ist in Abbildung 4A gezeigt. Das Bild wurde als Bild-Stack in Nikon Elements-Software mit einem Spot-Kamera auf dem Mikroskop montiert erworben. In diesem Beispiel Strom durch die Elektrode für ca. 2 Minuten vergangen. Die GF wird gründlich gefüllt und die große GF-Terminal in den Brustkorb ist gut beschriftet (Abbildung 4A, Ellipse). Keine postsynaptischen Neuronen sichtbar sind in diesem Fall, obwohl Lucifer Yellow ist klein genug, um durch gap junctions passieren. Wenn der Farbstoff nicht lange genug in die GF injiziert dann trans-synaptische füllt der postsynaptischen Neuronen möglicherweise nicht gesehen worden, da das Signal zu schwach, um nachgewiesen werden. Neurons postsynaptischen der GFS (4B, Pfeilspitzen) mehr zuverlässig visualisiert werden mit noch kleineren neuronale Tracer wie Neurobiotin. Injektion einer 7% Neurobiotin in 2 M Kaliumacetat-Lösung mit einem depolarisierenden Strom für 2 Minuten ist ausreichend, um postsynaptische Neuronen stark Etikett. Neurobiotin visualisiert werden können für die konfokale Mikroskopie mit Streptavidin gekoppelten Farbstoffe mit unterschiedlichen Wellenlängen. Da Neurobiotin ist nicht ein fluoreszierender Farbstoff, Co-Injektion von Rhodamin-Dextran oder Alexa Hydrazide in der gleichen Lösung, können verwendet werden, um eine erfolgreiche Injektion in die GF (4C, von Boerner und Godenschwege, 2010 5) zu überwachen. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung einer Fliege von der Seite gesehen. Der Brustkorb wird mit einem Längsschnitt, um die internen Strukturen zu visualisieren angezeigt. Während der Dissektion wurden die dorsalen Längs Flugmuskulatur (DLMs, blau) ohne Beschädigung der Bauchmark (VNC, tief rot), die ventral der Flugmuskulatur liegt geschnitten. Der Darm (grün) liegt oberhalb des VNC. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Dorsalansicht eines seziert fliegen. Zwei Stifte werden hinter dem Kopf platziert, um die Fliege Position. Die Stifte durch die Flugmuskeln (DLM) angebracht halten den Brustkorb zu öffnen. Innere Organe wurden entfernt, um das Bauchmark (VNC) aussetzen. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Dye füllen Setup. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. A) Z-Projektion der hintere Teil des VNC Darstellung eines GF mit Lucifer Yellow gefüllt. Das Bild wurde unmittelbar nach der Farbstoff Füllung mit einem Spot-Kamera erworben. In Wildtyp-Tieren das Terminal (Ellipse) in den Thorax ist deutlich sichtbar. B) Konfokale Aufnahme eines GF Farbstoff mit Neurobiotin füllen in einem Wildtyp-fly. Beide GFS (Pfeile) und Neuronen postsynaptischen der GFS (Pfeilspitzen) sind markiert. Neurobiotin visualisiert wurde mit Streptavidin an Cy3 gekoppelt. C) Die konfokale Bild von Wildtyp-GF gefüllt mit Alexa555.

<ol>
	<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Boerner, J., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+shape+standard+atlas+for+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord.">Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+sity.">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity.</a> J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+for+the+Drosophila+ventral+nerve+cord+standard+in+neuronal+circuit+reconstruction+and+in-depth+analysis+of+mutant+morphology.">Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology.</a> J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).</li><li>Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conderved+role+for+Drosophila+Neuroglian+and+human+L1-CAM+in+central-synapse+formation.">A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation.</a> Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).</li><li>Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+distinct+from+highwire+for+the+Drosophila+ubiquitin+conjugase+bendless+in+synaptic+growth+and+maturation.">A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation.</a> J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).</li><li>Storkebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+mutations+in+the+tyrosyl-tRNA+synthetase+gene+recapitulate+in+Drosophila+features+of+human+Charcot-Marie-Tooth+neuropathy.">Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+(GFS).">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li></ol>

Das Nervensystem kann ohne es zu extrahieren aus dem Körper fliegen seziert werden. Dies hat zwei Vorteile, erstens, bewirkt, dass die Zergliederung wenig Schaden für das Nervensystem, und zweitens, die meisten Nerven angeschlossen bleiben, um die Muskeln und Sinnesorgane. Durchführen der Dissektion, wie beschrieben, bereitet die Proben für geradlinig Farbstoff-Kennzeichnung der GFS. Günstig, bleiben die Motoneuronen postsynaptischen der GF an die Muskeln. Axone, also unbeschädigt sind, halten die Neuronen länger...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Scissors Superfine </td><td> Academic Instruments </td><td> VS1023 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzetten Dumontstar 55 </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz Insect Pins </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Ø 0,1 mm </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Elektroden </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Vertical Pipette Puller 700c </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 700C </td><td></td></tr><tr><td> Lucifer Yellow CH Dilithiumsalz </td><td> Sigma </td><td> L0259 </td><td> 1% in H 2 O </td></tr><tr><td> Fixed Stage aufrechten Mikroskop und Kamera </td><td> Nikon </td><td> FN-1 &amp; DS-U2-Kamera </td><td></td></tr><tr><td> Plan Fluor 10x Air Ziel </td><td> Nikon </td><td> CFI Plan Fluor 10x NA 0.3 WD 16mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluor 40x Wasser getaucht Ziel </td><td> Nikon </td><td> CFI Fluor 40x W NA 0,80 WD 2,0 mm </td><td></td></tr><tr><td> 3D-hydraulischen Mikromanipulator </td><td> Narishige Internationalen </td><td> Modell MW0-3 </td><td></td></tr><tr><td> Verstärker </td><td> Erste Instruments, Inc. </td><td> Modell 5A </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount preparation of the adult drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection

Zur Analyse der axonalen und dendritischen Morphologie von Neuronen, ist es wichtig, die genaue Kennzeichnung von neuronalen Strukturen zu erhalten. Vorbereitung gut markierten Proben mit wenig bis gar keine Gewebeschäden ermöglicht es uns, Zellmorphologie zu analysieren und einzelne Proben miteinander zu vergleichen, so die Möglichkeit, die Identifizierung von Mutanten Anomalien. In der Sektion zeigte Methode des Nervensystems bleibt meist im Inneren des Erwachsenen fliegen. Durch eine dorsale Inzision, sind der Bauch und Brustkorb geöffnet und die meisten der inneren Organe entfernt werden. Nur die Rückenseite des Bauchmark (VNC) und der Hals-Binde (CVC) mit den großen Axone der riesigen Fasern (GF) 1 ausgesetzt sind, während das Gehirn mit dem GF Zellkörper und Dendriten bleibt 2 in der intakten Kopf . In dieser Vorbereitung die meisten Nerven des VNC sollte, um ihre Muskeln verbunden bleiben. Nach der Präparation wird die intrazelluläre Befüllung der riesigen Glasfaser (GF) mit einem fluoreszierenden Farbstoff nachgewiesen. In der CVC die GF Axone sind an der dorsalen Oberfläche liegt und somit können leicht sichtbar unter dem Mikroskop mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik. Dies ermöglicht die Injektion des GF Axone mit Farbstoff an dieser Stelle auf die gesamte GF einschließlich der Axone und ihre Terminals in den VNC-Label. Diese Methode führt zu zuverlässigen und starken Färbung der GF so dass die Neuronen, um sofort nach dem Befüllen mit einer epifluoreszenten Mikroskop abgebildet werden. Alternativ kann die Fluoreszenz-Signal verstärkt mit Standard-Immunhistochemie Verfahren 3 geeignet für hohe Auflösung der konfokalen Mikroskopie werden.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection at JoVE.com

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Dissektion der erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt; Bauchmark (VNC) ist bewiesen. Diese besondere Dissektion Methode verursacht kaum Schäden an den VNC ermöglicht die spätere Kennzeichnung des riesigen Faser Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoff für hochauflösende Bildgebung.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

whole-mount-preparation-adult-drosophila-ventral-nerve-cord-for-giant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

18.9K Aufrufe.  Florida Atlantic University. Ein In vivo Dissektion der erwachsenen Drosophila Bauchmark (VNC) ist bewiesen. Diese besondere Dissektion Methode verursacht kaum Schäden an den VNC ermöglicht die spätere Kennzeichnung des riesigen Faser Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoff für hochauflösende Bildgebung.

Serie: Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...