Um eine Lebendzellbildgebung des Larvengehirns des dritten Stadiums durchzuführen, beginnen Sie mit der Entnahme der präparierten Gehirne und der isolierten Fettkörper in der letzten Vertiefung einer Dissektionsschale mit drei Vertiefungen, die das Sezier- und Bildgebungsmedium enthält. Legen Sie eine gasdurchlässige Membran auf die Rückseite eines Objektträgers und drücken Sie den Spaltring in die Mitte. Mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette werden bis zu 10 präparierte Gehirne mit maximal möglichen Fettkörpern und 130 bis 140 Mikrolitern des Mediums auf die Mitte der Membran übertragen.
Richten Sie die Gehirne entsprechend der abzubildenden neuralen Stammzellpopulation und des Mikroskoptyps aus, um sicherzustellen, dass sich die Proben in der Nähe des Objektivs des Mikroskops befinden. Um beispielsweise neurale Stammzellen in den zentralen Hirnlappen abzubilden, stellen Sie sicher, dass die Hirnlappen dem Ziel am nächsten sind. Legen Sie dann vorsichtig einen Glasdeckel über die Lösung auf die Membran, um die Lösung mit dem Gehirn und dem Fettkörper in der gesamten Membran zu verteilen.
Halten Sie das Laborpapier an den Rand des Deckglases, um überschüssige Lösung abzutupfen, bis das Gehirn das Deckglas berührt, ohne gequetscht zu werden. Als nächstes immobilisieren Sie das Deckglas, indem Sie geschmolzene Vaseline mit einem Pinsel entlang der Ränder auftragen und das Gelee fest werden lassen. Geben Sie 400 Mikroliter Bildgebungsmedium in eine Vertiefung in einem Multi-Well-Mikroobjektträger.
Übertragen Sie die zuvor präparierten Fettkörper in diese Vertiefung. Platzieren Sie dann bis zu 10 Gehirne in einem Cluster in der Nähe der Mitte des Brunnens. Richten Sie die Gehirne entsprechend der abzubildenden neuralen Stammzellpopulation und des Mikroskoptyps aus.
Lassen Sie das Gehirn zwei bis fünf Minuten im Brunnen ruhen. Decken Sie den Objektträger mit der Objektträgerabdeckung ab, bevor Sie ihn in das Mikroskop einsetzen. Starten Sie den Aufnahmeprozess mit der niedrigsten Laserleistung und Belichtungszeit, um das Ausbleichen der Fotos zu minimieren.
Die Bildgebung von Larvengehirnen, die UAS-getriebenes Cherry-Jupiter und androgyn markierte Pins GFP exprimierten, mit Hilfe von Multi-Well-Imaging-Objektträgern und ohne Fettkörpersupplementierung zeigte, dass die Pins in sich teilenden Neuroblasten eine ausgeprägte apikale Sichel bildeten, auf die sich die mitotischen Spindeln während der Mitose konsistent ausrichteten. In diesen Proben nahm die Länge des Zellzyklus mit zunehmender Bildgebungszeit zu. Proben, die in einem mit Fettkörpern angereicherten Medium auf einem membrangebundenen Objektträger abgebildet wurden, zeigten keine Zunahme der Zellzykluslänge.
Des Weiteren wurden Neuroblasten mit vier Teilung auf dem 10-stündigen membrangebundenen Objektträger beobachtet.
