Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in Bezug auf die genetische Regulierung der Bildung und Aufrechterhaltung der Blut - Hirn-Schranke während mehrerer Stadien der Drosophila-Entwicklung zu beantworten. Diese Methode kann auch angepasst werden, um die Durchlässigkeit anderer Barrieren, wie das Darmepithel in einer Vielzahl von Organismen, zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die Bewertung der Blut - Hirn-Barriere-Funktion in lebenden Geweben ermöglicht.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Beispielmanipulationen schwierig sein können und viele Schritte viel Liebe zum Detail erfordern. Für die Embryo-Sammlung stellen Sie mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen pro Flasche mit Corn Meal Agar Nahrung und inkubieren diese Fliegen für ein bis zwei Tage vor Beginn der Sammlungen. Am Tag vor der Sammlung, warme Apfelsaft Agar Teller bei 25 Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Morgen die Kohlendioxid-Anästhesisierten fliegen in einen Sammelkäfig geben und einen vorgewärmten Apfelsaft-Agarteller mit einem kleinen Abstrich von Hefepaste auf das offene Ende des Käfigs legen. Dann befestigen Sie die Platte mit der roten Hülse am Käfig. Um ältere Embryonen zu löschen, lassen Sie die Fliegen Eier auf einem Apfelsaft-Agar-Teller für eine Stunde bei 25 Grad Celsius legen.
Am Ende der Inkubation, invertieren Sie das Käfignetz Seite nach unten und tippen Sie die Fliegen an den Boden des Käfigs. Ersetzen Sie den Apfelsaft-Agar durch einen neuen vorgewärmten Apfelsaft-Agarteller mit einem kleinen Abstrich aus Hefepaste. Lassen Sie die Fliegen Eier für eine weitere Stunde bei 25 Grad Celsius auf den neuen Teller legen.
Um 17 Embryonen im späten Stadium zur Injektion zu sammeln, ersetzen Sie den Apfelsaft-Agarteller durch eine neue vorgewärmte Platte mit einem Abstrich aus Hefepaste. Und lassen Sie die Fliegen Eier auf dem Teller bei 25 Grad Celsius legen. Nach einer Stunde die Platte ersetzen und die Platte 19 Stunden bei 25 Grad Celsius durch gesammelte Embryonen altern lassen, so dass die Embryonen zum Zeitpunkt der Bildgebung 20 bis 21 Stunden alt sind.
Am Ende der 19-stündigen Inkubation entfernen Sie die Embryo-Entnahmeplatte aus dem Inkubator und bedecken Sie die Oberfläche der Platte mit PbTx. Lösen Sie die Embryonen mit einem Pinsel von der Plattenoberfläche in ein 70 Mikrometer Nylon-Netzsieb. Und legen Sie das Sieb mit Embryonen in 50%Bleichlösung in einer 100-Millimeter-Petrischale für fünf Minuten mit gelegentlicher Erregung bei Raumtemperatur, um sie zu dechorinieren.
Am Ende der Inkubation spülen Sie die Embryonen dreimal, indem Sie das Sieb in frischem PbTx wirbeln, wobei Sie für jede Wäsche eine neue Petrischale verwenden. Waschen Sie Embryonen mit PbTx auf eine Seite des Siebs und übertragen Sie die Embryonen mit einer Glaspipette auf eine 2%Agarose-Gelplatte. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier.
Richten Sie sechs bis acht Embryonen auf der Platte mit den Hintern nach rechts und den dorsalen Seiten nach oben aus und drücken Sie fest ein Stück doppelseitiges Klebeband, das auf einer Folie auf den Embryonen befestigt ist. Dann die Embryonen bei Raumtemperatur für etwa 25 Minuten abpflanzen, bevor sie die Proben mit Halocarbonöl bedecken. Für die Larvensammlung, richten Sie ein Kreuz mit 5 bis 10 jungfräulichen weiblichen Fliegen des gewünschten Genotyps und halb so viele Männchen des gewünschten Genotyps in einer Durchstechflasche mit Cornmeal Agar Nahrung.
Nach fünf bis sieben Tagen bei 25 Grad Celsius, je nach Genotyp, verwenden Sie Zangen, um wandernde dritte Instar-Larven sanft aus der Durchstechflasche zu sammeln und die Larven mit PBS zu spülen, um festsitzende Nahrung zu entfernen. Übertragen Sie die Larven auf eine Apfelsaft-Agarplatte für die Genotypisierung, bevor Sie die Larven mit einem Pinsel mit einem Pinsel auf einem Gewebe trocknen. Dann verwenden Sie Zangen, um sechs bis acht Larven auf eine Folie mit doppelseitigem Klebeband vorbereitet zu übertragen.
Verwenden Sie vor der Injektion einen Mikropipette-Puller, um Kapillarrohre in eine Standard-Nadelform für D.Melanogaster-Injektionen zu ziehen und die Nadeln in Ton in einer Petrischale zu verankern. Für die Embryoinjektion verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Gel-Ladepipettenspitze, um eine vorbereitete Nadel mit 5 Mikrolitern von 10 Kilodalton Dextran konjugiert zu Sulforhodamin 101 Säurechlorid zu laden und die Nadel in einen Nadelhalter zu laden. Positionieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator, der an einem Stahlsockel befestigt ist, und stellen Sie das Injektionsgerät auf 50 Pfund pro Quadratzoll und 5 bis 10 Millisekunden mit einem Bereich von 10 ein.
Platzieren Sie die Folie auf der Mikromanipulator-Bühne und bürsten Sie die Kante der Nadel gegen die Kante des doppelseitigen Bandes in einem 45-Grad-Winkel, um eine leicht abgewinkelte Spitze zu erzeugen, die gerade so gebrochen ist, dass der Fluss des 10 Kilodalton Dextran durch die Öffnung fließt. Pumpen Sie das Fußpedal, bis sich der Farbstoff an der Spitze der Nadel befindet. Richten Sie die Nadel so aus, dass sie parallel zum Embryo ist, und punktieren Sie das hintere Ende der Probe.
Pumpen Sie das Fußpedal, um zwei Nanoliter Farbstoff in die Probe zu injizieren. Beachten Sie die Zeit der Injektion für Inkubationszwecke und fahren Sie auf dem Dia fort, um zusätzliche Proben zu injizieren. Für die Larveninjektion eine etwas größere Winkelöffnung als die, die für die Injektion von Embryonen verwendet wird, und winkeln Sie die Nadel leicht nach unten zur Probe, bevor Sie die Larven mit 220 Nanolitern injizieren, ähnlich wie bei embryonalen Proben nachgewiesen.
Am Ende der 10-minütigen Injektionsinkubation verwenden Sie einen Baumwoll-Applikator, um Petroleumgelee auf der rechten und linken Seite der Proben auf der Rutsche als Abstandsraum aufzutragen. Positionieren Sie den Deckelschlupf oben und platzieren Sie den Schlitten auf die konfokale Mikroskopstufe. Wählen Sie das 20X-Objektiv aus und stellen Sie die Proben in der Tiefe jedes Embryos ab.
Dann berechnen Sie den Prozentsatz der Proben mit einer kompromittierten Blut - Hirn-Schranke nach der Formel. Bevor Sie mit dem Sezierverfahren beginnen, verwenden Sie Nagellack, um zwei Abdeckungsrutschen im Abstand von etwa 0,5 Zentimetern auf einem Dia zu montieren und eine injizierte Larve am Ende der 30-minütigen Inkubation in PBS auf die Folie zu legen. Greifen Sie mit einem Zangenpaar die Larve auf halbem Weg in den Larvenkörper und verwenden Sie ein zweites Zangenpaar, um die vordere und die hintere Hälfte der Larve zu trennen.
Als nächstes verwenden Sie ein Paar Zangen, um den vorderen Bereich an den Mundhaken zu greifen und das zweite Zangenpaar zu verwenden, um die Körperwand über der Spitze des ersten Zangenpaares umzukehren. Das Gehirn und die ventrale Nervenschnur werden ausgesetzt. Trennen Sie das Gehirn und die ventrale Nervenschnur von der Körperwand, indem Sie bei Bedarf die Nerven trennen und die Körperwand von der Rutsche entfernen.
Bedecken Sie die Probe mit 10 Mikroliter 80% Glycerin. Legen Sie dann einen Abdeckzettel auf die Probe für die Bildgebung und Bild der Proben, um den Prozentsatz der Proben mit einer kompromittierten Blut - Hirn-Schranke zu bestimmen, wie gezeigt. Wenn wilde Art spätstadium 17 Embryonen mit 10 Kilodalton Dextran konjugiert sulforhodamin 101 Säurechlorid Fluoreszenzfarbstoff injiziert werden, wird das große Dextran-Molekül aus der ventralen Nervenschnur ausgeschlossen, wie erwartet.
Heterozygote rohe 1 mutierte Embryonen weisen eine intakte Blut-Hirn-Schranke auf, ähnlich wie bei wilden Typkontrollembryonen. Im Gegensatz dazu weisen homozygote rohe 1 mutierte Embryonen Defekte in der Integrität der Blut-Hirn-Schranke auf, wobei der 10 Kilodalton Dextran in die ventrale Nervenschnur strömt, was auf ein Versagen der Blut-Hirn-Schranke hindeutet. In wilden Typ-Kontroll-Larvenproben, 10 Kilodalton Dextran nicht in die Blut - Hirn-Schranke eindringen und ist aus dem Gehirn und ventrale Nervenschnur ausgeschlossen.
Bei diesem Versuch ist die richtige Alterung der Embryonen entscheidend, um sicherzustellen, dass die Proben in einem Alter untersucht werden, in dem die Bildung einer Blut- und Hirnschrankenbildung abgeschlossen sein soll. Nach diesem Verfahren können Mutanten, die eine kompromittierte Blut-Hirn-Schranke aufweisen, mit Hilfe von Genetik, Immunhistochemie und Mikroskopie untersucht werden, um die Genfunktion auf zellulärer Ebene besser zu verstehen. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, zusätzliche Gene zu identifizieren, die für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke entscheidend sind.
