Legen Sie zunächst ein Aliquot von Liposomen in ein Wasserbad bei Raumtemperatur, um die Vesikel aufzutauen. Äquilibrieren Sie einen Extruder, der mit einem Filter mit Puffer A ausgestattet ist, und leiten Sie dann die aufgetauten Liposomen 13 Mal in den Extruder. Sammeln Sie die extrudierten Liposomen in einem Kunststoffröhrchen, um das Totvolumen zu minimieren.
Pipettieren Sie anschließend einen Milliliter der verdünnten Liposomenlösung in eine transparente Küvette. Messen Sie die anfängliche optische Dichte bei 540 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Geben Sie 50 Mikroliter 10% Triton X-100 zu den Liposomen.
Wenn die Lösung die maximale optische Dichte erreicht hat, titrieren Sie sie gegen Triton X-100, bis eine optische Dichte von 60 % Sättigung erreicht ist. Gießen Sie die durch das Reinigungsmittel destabilisierten Vesikel zurück in die Kunststofftube. Als nächstes fügen Sie das gereinigte Membranprotein zu den destabilisierten Liposomen hinzu, bis ein gewünschtes Verhältnis von 400 zu 1 erreicht ist.
Die Proben werden 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius nutatiert. Fügen Sie dann 200 Milligramm waschdichte, entfeuchtete Polystyrolkügelchen hinzu, um das Waschmittel zu entfernen. Befestigen Sie nun eine leere 10-Milliliter-Schwerkraft-Durchflusssäule über einem leeren 6,5-Milliliter-Ultrazentrierröhrchen, das auf Eis gestellt wird.
Gießen Sie die Probe in die Schwerkraftflusssäule und sammeln Sie die Proteoliposomen im Ultrazentrifugationsröhrchen. Gib 0,5 Milliliter Puffer A zu den Kügelchen. Sammeln Sie das Filtrat im Ultrazentrifugationsröhrchen.
Legen Sie anschließend die Liposomen in eine Ultrazentrifuge, um sie zu konzentrieren. Nach dem Verwerfen des Überstands resuspendieren Sie die pelletierten Proteoliposomen in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern Puffer A.Teilen Sie das endgültige Volumen der Proteoliposomen in drei Aliquote auf. Geringe Mengen an Triton X-100 führten zunächst zu einer Erhöhung der Absorption um 540 Nanometer.
Eine weitere Zugabe führte zu einer teilweisen Solubilisierung der Vesikel. Bei unserem Rsol wurden die Liposomen vollständig solubilisiert.
