Die Autoren danken den Armenise-Harvard-Stiftung, die Marie-Curie-Trentino COFUND (ACS), die Autonome Provinz Trient (Ecomm) und CIBIO für die Finanzierung.

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage <ol><li> Entschlacken Plasmid aus einem Standard-Labor-Stamm von E. coli, wie E. coli DH5a oder Nova Blau mit einem kommerziellen Kit. Alternativ kann eine lineare PCR-Produkt in ähnlicher Weise mit einem kommerziellen Kit gereinigt werden. Eluieren der DNA mit H 2 O nur. </li><li> Phenol-Chloroform extrahieren die DNA-Lösung 26. </li><li> Bestimmen der DNA-Konzentration und Reinheit durch UV-Absorption oder andere geeignete Verfahren, zB. Es ist wichtig, hochreinen DNA für eine effiziente Transkription-Translation verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereiten der Thin Film Lipid <ol><li> Das trockene Lipidpulver und lösen sich in Lösungsmittel. Für 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) werden Stammlösungen in Chloroform bei einer Konzentration von 40 mg / ml hergestellt. Hinweis: Organische Lösemittel muss immer mit Glaspipetten und Flaschen verarbeitet werden. Mit anderen Worten, sind die Kunststoffteile nicht verwendet werden. Shop stock Lösungen in luftdichten, Lösungsmittel beständig Braunglasflaschen bei -20 ° C, vorzugsweise unter Argon. </li><li> Aliquot 12 mmol POPC (220 ul von 40 mg / ml Stammlösung) in eine 5 ml-Rundkolben. </li><li> Verdampft das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (Abbildung 1), um die dünne Lipid-Film zu erzeugen. <ol><li> Befestigen Sie den Rundkolben der Destillation Rohr mit einem kreisförmigen Clip und starten Sie die Rotation des Kolbens. </li><li> Initiieren Sie die Zirkulation des Wassers durch den Verflüssiger. Mit einem Wärmebad ist nicht notwendig, da Chloroform hat einen niedrigen Siedepunkt von 61,2 ° C bei Normaldruck. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das System zur Atmosphäre hin offen, indem dass der Hahn geöffnet ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe und schließen Sie langsam den Hahn, um das Vakuum auf das System anzuwenden. </li><li> Ein dünner Lipidfilm an der Wand des Rundkolben während Rotationsverdampfung Bilden eines opaken Films abgelagertdas ist mit bloßem Auge sichtbar. Lassen Sie die Rotationsverdampfen für 0,5-2 Stunden fortsetzen. Um den Prozess zu stoppen, langsam loslassen den Unterdruck, stoppen Sie die Rotation, und entfernen Sie den Rundkolben. </li></ol></li></ol> 3. Lipid Resuspension und Vesicle Homogenisierung <ol><li> 1 ml 18,2 MOhm H 2 O auf die dünne Lipid-Film direkt in den Rundkolben. Kräftig Wirbel die Lösung bei maximaler Geschwindigkeit etwa 3.200 Umdrehungen pro Minute, bis die Lipid-Film löst sich von Glas, die mit bloßem Auge beobachtbar ist. </li><li> Übertragen Sie die Lipid-Dispersion in ein 2 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Set-up ein Ring stehen, um einen Homogenisator mit einer 5 mm Spitze zu halten. Legen Sie eine Mikrozentrifuge Stand unterhalb der Homogenisator einen sicheren Halt des Lipiddispersion. Spülen Sie die Dispergierelement der Homogenisator durch Eintauchen der Spitze in 18,2 MOhm H 2 O und läuft für ein paar Sekunden. </li><li> Legen Sie die Dispergierelement direkt in den Lipiddispersion Gewährleistung than der Spitze nicht berühren den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens. Homogenisieren für 1 min auf Stufe 4 oder 14.000 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 4. Vesicle Extrusion und Gefriertrocknung <ol><li> Montieren Sie die Teile des Mini-Extruder (Abbildung 2), die aus einem äußeren Gehäuse besteht und eine Überwurfmutter, die zwei Teflon-Membran unterstützt, zwei O-Ringen und einem Teflon Lager beherbergt. <ol><li> Zeigen die beiden O-Ringe in die Nuten der inneren Membran unterstützt. Prewet zwei Filtern und einem 400 nm Membran. Die Filter werden auf die Teflon innerhalb der O-Ringe werden mit der Membran zwischen ihnen platziert. </li><li> Zeigen die Membran unterstützt in den Extruder äußeren Gehäuse und der Membran durch zwei Filter zwischen den O-Ringen umgeben. Legen Sie die Teflon Lager im Inneren des Gehäuses und befestigen Sie die Überwurfmutter und von Hand anziehen. </li></ol></li><li> Spülen Sie zwei Spritzen und füllen mit einem 18,2 MOhm Wasser. Legen Sie die Spritze Nadeln in das kleine holes im Teflon an jedem Ende des Extruders Montage. Die Nadeln sollten in leicht schieben, nicht mit Gewalt die Nadeln. Sichern Sie den Extruder mit den Spritzen in den Extruder Gehäuse und befestigen. </li><li> Führen Sie das Wasser durch den Extruder, indem Sie langsam das Wasser aus einer Spritze und in die andere. Dies stellt einen Durchgang. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Durchgänge gewährleisten, dass es keine Lecks vorhanden sind. Entfernen Sie die Spritze mit Wasser und entsorgen des Wassers. </li><li> Füllen einer Spritze mit der Probe, dem Extruder befestigt und langsam an den Vesikel-Lösung durch die Membran, wie oben beschrieben in Schritt 4.3. Wiederholen 10x für insgesamt 11 Kanäle. Da die Extrusion Prozess wird die Probe weniger trübe und leichter durch die Membran zu drücken. Eine plötzliche Abnahme des Widerstandes jedoch gewöhnlich einen Zerreißen der Membran. </li><li> Übertragen Sie die extrudierte Vesikel-Lösung und machen 40 ul Aliquots der Vesikel in Mikrozentrifugenröhrchen.Blitz einfrieren Jedes Aliquot entweder Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff. </li><li> Lyophilisieren jedes Aliquot mit einem Zentrifugalverdampfer Nacht bei 30 ° C. Bewahren Sie die lyophilisierten leeren Vesikel bei -20 ° C. </li></ol> 5. Kapselung Transkriptions-Translations-Maschinerie <ol><li> Mischen der Komponenten des Transkriptions-Translations-Reaktion fügt 20 Einheiten RNase-Inhibitor. Inkubation auf Eis. </li><li> In der DNA-Vorlage. Für eine Kontrollreaktion, 250 ng von einem Plasmid oder einem ähnlichen mVenus fluoreszierendes Protein hinter einem T7-Transkriptions-Promotor und ein starker E. coli Ribosomenbindungsstelle empfohlen. </li><li> Bringen Sie das Endvolumen auf 25 ul mit RNase-freiem Wasser. </li><li> Hydrate ein Aliquot lyophilisierter Vesikeln (aus Stufe 4.6) mit 10 ul der Umsetzung in Schritt 5.3 montiert. Vortexen der Mischung, bis die Bläschen sind suspendiert. Das sollte weniger als 30 Sekunden. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 30 min, um die Vesikel zu schwellen. </li><li> Verdünnen Sie die Vesikel Mischung 20-fach bis zu einem Endvolumen von 30 ul durch Zugabe von 1,5 ul Vesikel in 27,0 ul 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 und 1,5 ul von 20,2 mg / ml Proteinase K. DNase und RNase kann auch an dieser Stelle hinzugefügt werden, als Alternative zur Proteinase K extravesikulären Material abbauen zu können. </li><li> Inkubieren für mindestens 2,5 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> 6. Mikroskopie <ol><li> Untersuchen Sie die Vesikel und den Fortschritt des fluoreszierenden Proteins Produktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Vesikel werden einen größeren Durchmesser als die 400 nm Porengröße der Membran für Vesikel Extrusion. <ol><li> Bereiten Sie einen Probenraum, indem ein 20 x 5 mm Silizium-Spacer auf eine Standard-Objektträger. Je 10 ul Vesikel in den Probenraum. Legen Sie einen silikonisierten Deckglas über die Kammer. </li><li> Beachten Sie die Vesikel mit einem 63X Öl-Dispersion or ähnliches Ziel von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie mit dem entsprechenden Filter-Set für die Ausgebeuteten fluoreszierenden Proteins. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Obwohl zellfreien synthetischen Biologie ist immer noch in den Kinderschuhen steckt, haben Fortschritte ein Fundament, von dem zunehmend komplexen Zell-ähnlichen Systemen gemacht werden verlegt. Die Wiederherstellung der Transkriptions-Translations-Maschinen aus vollständig definierten Komponenten 9 innerhalb von Vesikeln 28 war von besonderer Bedeutung bei der Erleichterung später Anstrengungen beim Bau umweltfreundlicher reagiert künstliche cells17, 18. Ebenso künstlichen Zelle Studien verwendet worden, um Sonde Evolutionsprozessen 4,29,30, den Mechanismus zu RNA-und Proteinsynthese 22,31, die Einflüsse von metabolischen load32, 33 und die Anordnung von viralen Partikeln 34. Wichtig ist, dass genug Wissen existiert nun, dass grundlegende zelluläre Funktion innerhalb von Vesikeln können im Labor nach diesen früheren Berichten und den Protokollen beschrieben rekonstituiert werden. Abgesehen davon, dass einfach die beschriebene Kapselung procedure hat mehrere Vorteile. Zum Beispiel können viele leere, gefriergetrockneten Aliquots Vesikel im Voraus gebucht werden und bei -20 ° C für die spätere Verwendung. Das Protokoll nicht Gegenstand biologischer Moleküle, organische Lösungsmittel, starken Temperaturschwankungen oder lange Zeiträume der Dialyse. Wir erwarten, dass die Sanftheit des Verfahrens wird den Einbau von zusätzlichen Komponenten zu erleichtern, wie gebraucht. Wir haben auch keine negativen Auswirkungen auf die Änderung der Lipidzusammensetzung der Membran auf Einkapselung oder Transkriptions-Translations-Effizienz beobachtet. Daher könnte Lipide zugänglicher den Einbau von Membranproteinen, spezifische Morphologie oder Visualisierung denkbar ausgenutzt werden. Der größte Nachteil bei dem beschriebenen Verfahren ist, dass die resultierenden Vesikel nicht homogen in der Größe oder Lamellaritätsindex. Für viele Anwendungen sind diese Schwierigkeiten nicht mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen. Jedoch können bei Bedarf weitere Schritte schmalen th aufzunehmene Größenverteilung und verringern die Schichten der Membranen, wie weitere Runden der Extrusion nach der Einkapselung, Gefrier-Auftau-, Dialyse oder 35. Zweifellos bessere Methoden, die diese und andere Probleme zu umgehen entwickelt werden. Bis dahin finden wir das hier beschriebene Protokoll zu gut für den Bau von zellulären Mimik geeignet sein.

Zellfreie, in vitro Transkriptions-Translations-Reaktionen und die Erzeugung von Vesikeln aus synthetischen Lipiden sind nichts Neues. Doch die Kombination der beiden in eine zelluläre imitieren ist deutlich mehr challenging1-6. E. coli Zellextrakte mit oder ohne T7-RNA-Polymerase kann als Quelle der Transkriptions-Translations-Maschinerie 7,8 verwendet werden. Zellextrakte Nutzen aus dem Vorhandensein von zusätzlichen zellulären Komponenten, die Proteinexpression und Falten erleichtern. Alternativ kann auch eine Mischung aus einzeln gereinigt RNA-und Protein-Moleküle, dh die PURE System 9, können verwendet werden, um zu vermitteln intravesikulären Proteinsynthese 4,10-14 werden. Die PUR-System ermöglicht den Bau von vollständig definierten zellulären Mimik und nicht von der Nuklease-Aktivität in Zellextrakten vorhanden leiden. Praktisch bedeutet dies, dass viel weniger DNA-Template benötigt wird, wodurch Prozesse mit niedrigem Verkapselungswirksamkeit 11 </sup&gt;. Obwohl weniger häufig verwendet werden, können zelluläre Mimetika mit Zellextrakten aus eukaryotischen cells15 abgeleitet gebaut werden. Bisher wurden genetisch kodierte gekapselten Kaskaden und zellulären Mimetika, die die Umwelt spüren worden 16-18 gemeldet. Der einfachste Weg, Transkriptions-Translations-Reaktionen zu überwachen ist, die Fluoreszenz-oder Lumineszenz von genetisch codierten Elemente zu messen. Typischerweise werden Glühwürmchenluciferase 19 oder GFP verwendet, obwohl in vitro Reaktionen häufig durch radioaktive Markierung gemessen werden. Fluoreszenzdetektion ermöglicht zusätzlich zur Überwachung der Populationen von Vesikeln 20,21 durch Durchflusszytometrie basierende Verfahren und bietet damit einen Einblick in die stochastische Natur der biologischen Fortsätze. Diese Monitoring-Methoden wurden genutzt, um eine kleine Gruppe von Design-Regeln und eine Bibliothek von Teilen, von denen aus zu bauen, darunter eine Sammlung von fluoreszierenden Proteinen, die kompatibel mit i definierenn vitro Transkriptions-Translations-22, den Einfluss der genetischen Organisation Ausdruck 22, die Aktivität Sigmafaktoren 16 und die Effizienz der Transkriptionsterminatoren 23. Dennoch bleibt viel zu tun, die die Fähigkeit des Gebäudes in vitro vorhersehbar, genetisch codierte Geräte erhöhen werden muss. Es gibt viele Methoden, um Vesikel zu machen. Die gängigsten Methoden sind abhängig von der Erzeugung einer dünnen Lipidfilm auf einer Glasoberfläche durch Resuspension in wässrigen Solution24 gefolgt. Wenn die wässrige Lösung Transkriptions-Translations-Maschinen, zum Beispiel, dann ein Teil der Vesikel enthalten würde, die notwendigen Komponenten zur Herstellung von Proteinen. Allerdings ist die Verkapselungseffizienz solcher Verfahren gering, so dass nur ein kleiner Prozentsatz von Vesikeln aktiv sind. Viele der alternativen Methoden durch viel höhere Kapselung eff gekennzeichnetizienz nutzen die Umwandlung der Wasser-in-Öl-Emulsion Tröpfchen Vesikel. Während es wahrscheinlich ist, dass solche Methoden werden in Zukunft alltäglich, leiden derzeit diese Methoden von der Notwendigkeit von Spezialgeräten und geben Vesikel mit veränderten Zusammensetzungen Membran 25. Ein deutlicher Vorteil der Wasser-in-Öl-Vesikel-Verfahren ist das Potential Membran Lamellaritätsindex steuern. Das hier beschriebene Verfahren ist auf der dünnen Fettfilm Protokoll vom Yomo Labor 11 mit leichten Modifikationen einschließlich einer zusätzlichen Homogenisierung Schritt beschrieben wird. Diese Methode ist einfach, billig und robust Vesikel gibt auch für die Verkapselung von Transkriptions-Translations-Maschinen geeignet.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Da das Interesse Verschiebungen von einzelnen Molekülen in den Systemen der Moleküle haben eine zunehmende Zahl von Laboratorien versucht, von unten nach oben, die zelluläre Mimik besser zu vertreten, die Komplexität der zellulären Leben aufzubauen. Bis heute gibt es eine Reihe von Wegen, die ergriffen werden, um zelluläre compartmentalized Mimik bauen könnte, einschließlich der Nutzung von Wasser-in-Öl-Emulsionen, mikrofluidischen Bauteilen und Bläschen. Jede der Optionen hat spezifische Vor-und Nachteile. Zum Beispiel, geben Wasser-in-Öl-Emulsionen hohe Verkapselungseffizienz aber nicht gut imitieren die Permeabilitätsbarriere lebenden Zellen. Der primäre Vorteil der hier beschriebenen Verfahren ist, dass sie sich einfach und billig zu implementieren ist. Transkriptions-Translations-Maschinerie im Inneren des Phospholipid-Vesikel durch einen Prozess, gemeinsame Instrumente, wie z. B. einer Zentrifuge Verdampfer und einem Extruder nutzt verkapselt. Die Reaktionen werden durch Fluoreszenz-Spektroskopie verfolgt. Das Protokolls kann für die rekombinante Proteinexpression, den Bau von zellulären Mimik, die Erforschung der Mindestanforderungen für die zellulären Lebens, oder der Montage von genetischen Schaltung angepasst werden.

Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die Fluoreszenz nur im Inneren der Vesikel beobachtet, weil extravesikulären Material enzymatisch abgebaut (Abbildung 3). Für die Expression von mVenus beginnt intravesikulären Fluoreszenz nach 1,5 Stunden bei 37 ° C beobachtet werden und erreicht maximale Fluoreszenzintensität innerhalb von 6 Stunden. Die optimale Temperatur und Inkubationszeit kann in Abhängigkeit von den spezifischen verwendeten Konstrukte. Beispielsweise reifen verschiedenen fluoreszierenden Proteinen sehr unterschiedlich in einer temperaturabhängigen Weise. Mit anderen Worten, ist die Beobachtung der Proteinproduktion nicht allein abhängig Proteinsynthese und Falten, sondern auch von Chromophor-Bildung. Insgesamt kann die Proteinsynthese durch Einbau Membranprotein Poren auf einen Zustrom von abgereichertem Komponenten, die für die Transkription und Translation 27 erlauben erhöht werden. Es wird empfohlen, zur Durchführung einer analogen Transkriptions-Übersetzungention Reaktion in Abwesenheit von Vesikeln, um sicherzustellen, dass die ausgenutzt Genkonstrukt funktionsfähig ist. Diese Steuerung Reaktion wird leichter durch Fluoreszenz-Spektroskopie, anstatt Mikroskopie überwacht. Abbildung 4 zeigt eine in vitro Transkriptions-Translations-Reaktion eines Konstrukts Codierung mVenus. Unverkapseltem Reaktionen geben insgesamt viel höher als vergleichbare Fluoreszenzintensitäten intravesikulären Reaktionen. Dies ist aufgrund der Verkapselung Effizienz und aufgrund der insgesamt intravesikulären Volumen viel kleiner als die extravesikulären Volumen (dh ein Verdünnungseffekt). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Abbildung 1. Der Rotationsverdampfer und Vakuumpumpe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Abbildung 2. Das Gehäuse und Teile des Extruders werden gesondert ausgewiesen. Von links nach rechts, unterstützt Spritze, Überwurfmutter, Teflonlager, innere Membran mit schwarzen O-Ringe einander zugewandten Extruder Außengehäuse und zweite Spritze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Abbildung 3 Fluorescence Bilder mVenus Protein-Produktion in Liposomen A und C:.. Hellfeld Bilder multilamellarer Vesikel nach 1,5 h und 2,5 h und B &amp;# 160; D: Die Herstellung von mVenus durch Fluoreszenz (grün) nach 1,5 und 2,5 Stunden, jeweils visualisiert. Maßstab ist 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> 4. In vitro Kontrollreaktion von verkapselten in vitro Transkription und Translation mVenus. Fluoreszenzintensität wurde alle 5 min über 4 Stunden gemessen. Die Daten wurden mit einem Real-Time-PCR-Gerät erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Aufrufe.  University of Trento.  Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen. 

Serie: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Forschung

Biotechnik

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Finite-Elemente-Modellierung einer zellulären elektrischen Mikroumgebung

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.