Diese Maßnahme erstellt ein Minimalmodell der Zelle ohne komplexe biochemische Vorschriften. Die verwendete Technik kann eine hohe Ausbeute an Liposomen erzeugen und eine hohe Verkapselungseffizienz für Zytoskelettproteine aufweisen. Diese Maßnahme kann auf die Verkapselung einer Vielzahl von Proteinen und großen Objekten wie Mikropartikeln und selbstvorbereitenden Mikroschwimmern angewendet werden.
Ein Individuum kämpft darum, die Liposomenausbeute für die ersten Versuche zu erhöhen. Es wird empfohlen, regelmäßig einen Abschnitt des Manuskripts zu diskutieren, um weitere Details zu erhalten, um die Ausbeute zu erhöhen. Zu Beginn wird der wässrige innere Nichtpolymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter hergestellt, indem 0,1 Millimolar CACL zwei, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 320 Millimolar Saccharose und 0,2 Millimolar ATP gemischt werden.
Bereiten Sie die Proteinmischung vor, indem Sie Proteine in den inneren Nichtpolymerisationspuffer bei vier Grad Celsius geben. Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie der Proteinmischung 100 nanomolares Gellcalin, vier mikromolare Hustensäure und 2,2 mikromolare VCA HEZ hinzu. Als Kontrollexperiment ersetzen Sie die Proteinmischung durch 100 Mikrogramm pro Milliliter Fluoreszenzfarbstoff.
Bereiten Sie den wässrigen inneren Polymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter durch Mischen von 100 Millimolarkaliumchlorid vor. Vier Millimolar Magnesiumchlorid, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DABCO, 10 Millimolar ATP und 80 Millimolar Saccharose. Bereiten Sie den endgültigen Puffer vor, indem Sie den inneren Nichtpolymerisationspuffer und den inneren Polymerisationspuffer in einem Volumenverhältnis von eins zu eins mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern zu erhalten, das im Liposom eingekapselt wird.
Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer in einem Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern vor, indem Sie 10 Millimolar HEPES, 50 Millimolar Kaliumchlorid, zwei Millimolar Magnesiumchlorid, 0,2 Millimolar Calciumchlorid, zwei Millimolar ATP, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 212 Millimolar Glucose und 0,1 Milligramm pro Milliliter Beta-Gehäuse mischen. Um die Lipidölmischung vorzubereiten, beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Mikrolitern von 25 Milligramm pro Milliliter EGGPC in eine Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas und hinterlassen Sie einen trockenen festen Lipidfilm am Boden der Durchstechflasche.
Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie Nickellipid in einem Verhältnis von 10 zu eins von EGGPC zu Nickellipid hinzu und mischen Sie es, bevor Chloroform verdampft wird. Fügen Sie zwei Milliliter Mineralöl hinzu. Verdampfen Sie das Chloroform und beschallen Sie die Lipidölmischung bei Raumtemperatur in einem Bad für eine Stunde, um die Lipide zu resuspendieren.
Bereiten Sie eine abschließende Puffer-in-Öl-Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten. Beginnen Sie mit der Einnahme von 100 Mikrolitern der Lipidölmischung in einem Kunststoffröhrchen und fügen Sie der Lipidölmischung 10 Mikroliter Endpuffer hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich der letzte Puffer in einem Tröpfchen befindet.
Ziehen Sie mit einer Glasspritze zuerst eine kleine Menge Lipidölgemisch und dann den endgültigen Puffertropfen, indem Sie die Spitze der Spritze an die Peripherie des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Mehrmals vorsichtig auf und ab saugen, bis sich eine trübe Emulsion bildet. Geben Sie 30 Mikroliter Außenpuffer in ein separates Kunststoffrohr.
Legen Sie 30 Mikroliter der Lipidölmischung auf den äußeren Puffer und lassen Sie sie etwa 10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln. Um Liposomen herzustellen, fügen Sie vorsichtig 50 Mikroliter der endgültigen Pufferölemulsion in die oberste Ölphase des Röhrchens hinzu. Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren. Entfernen Sie vorsichtig die Ölphase, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.
Schneiden Sie mit einer neuen Pipette die Spitze der Pipette ab. Stecken Sie die Pipette langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln. Gießen Sie 100 Mikroliter Außenpuffer in den Brunnen einer Inkubationskammer.
Legen Sie die gesammelten Liposomen vorsichtig in den äußeren Puffer ab und legen Sie dann einen weiteren Abdeckstreifen auf die Kammer. Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Tauchobjektiv. Verwenden Sie 488, 647 und 561 Nanometer Laserlinien.
Zur Beobachtung fluoreszierend markierter Lipide, verkapselter Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszenzmarkiertes Aktin. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIF-Format. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in Bild J.Start, indem Sie die TIF-Datei mit der Image J-Software öffnen.
Gehe zum Bild und klicke dann auf "Anpassen". Passen Sie anschließend den Helligkeitskontrast an Helligkeit und Kontrast des Bildes an den gewünschten Maßstab an, indem Sie die minimalen und maximalen Einstellungen sowie die Helligkeits- und Kontrastregler anpassen. Klicken Sie auf das Rechteckauswahlwerkzeug in der Symbolleiste und wählen Sie den gewünschten Bereich aus.
Gehen Sie zum Bild und klicken Sie dann auf Zuschneiden, um den ROI zu beschneiden. Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Maßstab festlegen. Geben Sie im Popup-Fenster 1,0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie Mikrometer als Längeneinheit fest.
Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein. Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem ovalen Auswahlwerkzeug in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms.
Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Messen, um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann. Die erfolgreiche Liposomenerzeugung wird durch die Visualisierung des dünnen kreisförmigen Rings, der grün fluoreszierenden Lipiddoppelschicht, verifiziert. Unter einem 488-Nanometer-Laser mit konfokaler Mikroskopie zur Bestätigung der Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs.
Die innere Umgebung der Liposomen sollte unter einem 647-Nanometer-Laser gleichmäßig fluoreszierend sein. Die Bildung von Liposomen konnte durch die dünnen grünen kreisförmigen Ringe sichtbar gemacht werden. Die rekonstituierten Affekte in Netzwerken innerhalb von Liposomen sind heterogen und manifestieren sich als verzweigte Netzwerkstrukturen von Aktinfilamenten.
Die Zweigarchitektur wurde durch die Einführung des ARP two three complex ausgelöst, der zusammen mit VCA HEZ gleichzeitig die Keimbildung und Verzweigung von Aktinfilamenten steuert. Am inneren Blättchen der Doppelschicht von Liposomen entsteht eine dünne, aber dicht verzweigte Aktinschicht, die als fluoreszierender Schicht sichtbar gemacht werden kann. Die Lipid-Audio-Endpuffermischung muss im Allgemeinen durch eine Glasspritze hin und her gepumpt werden, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden.
Die Mischung muss nach dem Prozess weißlich sein. Diese Technik ebnete den Weg für den Aufbau eines Minimalmodells der Zelle, frei von komplexen biochemischen Vorschriften. Mit diesem zellnachahmenden System können Forscher die mechanischen und dynamischen Eigenschaften von Zytoskelettproteinen, Nukleator und molekularem Motor erforschen.
