Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Erzeugung von großflächigen Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken, in denen die einzelnen Nanoröhrchen ein Phasentrennungsverhalten aufweisen, das dem des Elternvesikels ähnelt. Der entscheidende Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass wir die Arbeit der molekularen Motoren kooptieren, um die Lipidnanoröhren hochgradig parallel und ohne menschliches Zutun selbst zusammenzusetzen. Um einen gleitenden Motilitätsassay einzurichten, befestigen Sie zunächst drei Sätze doppelseitiger Bandstreifen auf einem Glasobjektträger, der fünf Millimeter voneinander entfernt ist.
Drücken Sie vorsichtig einen Deckzettel auf das Band und geben Sie 30 Mikroliter einer einmikromolaren Kinesinlösung in die vorbereitete Durchflusszelle. Fügen Sie nach fünf Minuten 30 Mikroliter einer 10-Mikrogramm / Milliliter-Mikrotubuli-Lösung in die Zelle hinzu und drücken Sie ein Labortuch vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. Nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation waschen Sie die Zelle ein- bis dreimal mit 50 Mikrolitern Raumtemperatur-Motilitätslösung pro Waschgang, bevor Sie 30 Mikroliter 10-Mikrogramm / Milliliter Streptavidin-Lösung in die Durchflusszelle geben.
Nach 10 Minuten 30 Mikroliter einer 10-fachen GUV-Lösung für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter einer 100-Millimolaren AMP-PNP-Lösung hinzu und schließen Sie die Kammer mit Dichtmittel. Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filtersatz aus.
Verwenden Sie ein 100X-Ölobjektiv, um zuerst die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren, bevor Sie ein Bild eines interessanten Netzwerks aufnehmen. Öffnen Sie dann das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Farbe und Komposit, um die roten und grünen Kanäle zu überlagern und ein zusammengesetztes Bild zu erstellen. Öffnen Sie nach der Bildgebung das Bild von Interesse und klicken Sie auf Analysieren und Skala einstellen, um die Skala für das Mikroskop zu kalibrieren.
Geben Sie die Pixel in den Mikrometer-Umrechnungsfaktor ein und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie das Multi-Point-Line-Tool, um die Nanoröhrchen ausgehend vom übergeordneten GUV zu verfolgen, und halten Sie Control und M gedrückt, um die Länge zu messen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster. Wenn alle Röhren gemessen wurden, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, und klicken Sie auf Anwenden, um den Schwellenwert anzuwenden.
Zeichnen Sie dann ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr. Um die integrierte Dichte des Bereichs zu messen, klicken Sie auf Analysieren und Messen Um die Lipidpartitionierung in den flüssigen Nanoröhrenknoten zu bestimmen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie über den interessierenden Knoten zu zeichnen und die Knotenintensität sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu messen. In dieser repräsentativen Analyse wurden flüssige Nanoröhrchennetzwerke hergestellt, wie gezeigt wurde, um flüssigkeitsungeordnete und geordnete Phasen sowie phasengetrennte Vesikel zu erzeugen.
Zum Beispiel führen Vesikel, die mit 45% gesättigtem Lipid und 55% ungesättigtem Lipid synthetisiert werden, zu Vesikeln, die sich in koexistierende flüssigkeitsungeordnete und feste Phasen trennen. Wenn jedoch Cholesterin einbezogen wird, kann dann eine Flüssigkeit-Flüssig-Koexistenz beobachtet werden, wodurch GUVs entstehen, die sich in koexistierende flüssig geordnete und flüssigkeitsungeordnete Phasen trennen. Darüber hinaus können Knoten innerhalb der phasengetrennten Gemische beobachtet werden.
Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, die geeignete Belichtungszeit und das ND-Filterset auszuwählen, um die Lipidnanoröhren visualisieren zu können, ohne die Fluorophore photobleichen zu müssen. Die Anpassung der Zusammensetzung des Phasenverhaltens der Lipidnanoröhren ermöglicht es uns, ein minimalistisches Modellsystem zu verwenden, um die Biophysik der tunnelnden Nanoröhren zu untersuchen, die Zellen verbinden.
