Dieses Protokoll bietet ein Mittel zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelliger Ebene in riesigen Vesikeln. Es ist einfach, die riesigen Vesikel zu entwickeln, und nur ein sehr kleines Volumen an Probenlösung ist erforderlich, um die Vesikel vorzubereiten. Demonstriert wird das Verfahren von Juri Ota, einem Doktoranden aus unserem Labor.
Beginnen Sie mit 20 Mikroliter frisch zubereiteter POPC-Lösung und vier Mikroliter frisch zubereiteter Biotin-PEG-DSPE-Lösung zu einer Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom, bis sich ein Lipidfilm bildet. Legen Sie den Film für eine Stunde in einen Trockenbau, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.
Dann 200 Mikroliter Mineralöl in die Durchstechflasche geben. Die Öffnung der Durchstechflasche mit Kunststoffparaffinfolie abdecken und den Fläschcheninhalt in einem Ultraschallbad mindestens eine Stunde lang mit 120 Watt beschallen. Für eine kleine Vesikelzubereitung einen Lipidfilm erstellen, wie gerade gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter 200 Millimeter Glukose in LB Medium in den Film.
Dann beschallen Sie den Film mit 120 Watt für mindestens eine Stunde, gefolgt von der Extrusion der resultierenden Riesenbläschen in kleine Vesikel mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 100 Nanometern. Für bakterielle Zellpräkultur, impfen E.coli von einer LB-Platte in Milliliter LB Medium für eine Nachtkultur bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen 20 Mikroliter des Überstandes der Kultur für weitere zwei Stunden Kultur auf 1,98 Milliliter frisches LB-Medium übertragen.
Überprüfen Sie am Ende der Inkubation die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600-Wert der Vorkulturlösung auf einem Spektralphotometer. Es sollte eine vorkulturelle Lösung mit einem OD 600 von einem bis 1,5 verwendet werden. Dann mischen Sie die Vorkulturlösung mit frisch zubereiteter Saccharoselösung und frischem LB-Medium, so Tabelle eins.
Für die riesige Vesikelbildung 50 Mikroliter einer frisch zubereiteten äußeren wässrigen Lösung von Riesenbläschen zu einem 1,5 Milliliter-Kunststoffrohr hinzufügen. 150 Mikroliter der fetthaltigen Öllösung vorsichtig über die äußere wässrige Lösung von Riesenbläschen schichten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie überprüfen, ob die Schnittstelle des Öls und wässrige Lösungen flach ist.
Für Wasser und Öl Bakterienzelle enthalten Tropfen Bildung, fügen Sie zwei Mikroliter einer frisch zubereiteten inneren wässrigen Lösung von riesigen Vesikel zu 50 Mikroliter der beschallten lipidhaltigen Öllösung in einem 0,6 Milliliter Deckel Kunststoffrohr. Tippen Sie dann auf das Rohr, um die beiden Komponenten zu emulgieren. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um 50 Mikroliter Wasser und Öltröpfchenlösung an die Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung zu legen, und sedimentieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen durch Zentrifugation.
Dann die obere Ölschicht ansaugen und die riesigen Vesikel sammeln. Um eine handgefertigte Kammer vorzubereiten, bohren Sie ein Sieben-Millimeter-Loch mit einem Hohlstanz auf eine 10 mal 10 mal 10 mal einen Millimeter doppelseitige Dichtung, und fügen Sie dann die doppelseitige Dichtung auf ein 30 mal 40 Millimeter-Deckglas ein. Um eine unterstützte Zweischichtmembran vorzubereiten, fügen Sie 30 Mikroliter der kleinen Vesikellösung in das Loch der handgefertigten Kammer ein.
Inkubieren Sie die Vesikel bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 Mikroliter LB Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose. Um riesige Vesikel auf der Unterstützenden Zweischichtmembran zu immobilisieren, führen Sie 10 Mikroliter Neutravidin in äußere wässrige Riesenbläschenlösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in das Loch ein.
Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 MikroliterLB-Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose, und fügen Sie das gesamte Volumen der riesigen Vesikellösung in das Loch in der Kammer. Dann versiegeln Sie das Loch mit einem 18 mal 18 Millimeter-Abdeckungsglas. Um das Bakterienwachstum innerhalb der riesigen Vesikel zu überwachen, wählen Sie das 40-fache Objektiv auf einem invertierten Mikroskop aus, und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop-Heizbühnensystem.
Dann inkubieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen in der Kammer unter statischen Bedingungen für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius, wobei Sie alle 30 Minuten Bilder des Bakterienzellwachstums mit der wissenschaftlich komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera aufnehmen und aufzeichnen. Riesige Vesikel, die Bakterienzellen enthalten, haben in der Regel eine Größe von 10 bis 30 Mikrometern. Bei beiden Größen von Riesenbläschen durchlaufen die E.coli-Zellen Dehnungs- und Divisionsprozesse, wobei einige E.coli-Zellen während des sechsstündigen Beobachtungszeitraums zu einer sehr großen Anzahl von Zellen anwachsen.
Die relative Häufigkeit von Riesenvesikeln, die eine einzelne Zellebene enthalten, beträgt etwa 10% der erhaltenen Riesenbläschen, und die riesigen Vesikel, die auf der Ebene der Einzelzellen verkapselt sind, sind etwa 50% der riesigen Vesikel, die Bakterienzellen enthalten. Die Stabilität der Öl-Wasser-Schnittstelle ist wichtig für die Gewinnung von riesigen Vesikeln, die Bakterienzellen enthalten. Achten Sie darauf, das Öl sorgfältig vor der riesigen Vesikelkorrektur zu aspirieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterielle Zellen auf einzelzelliger Ebene innerhalb einzelner Riesenbläschen kultiviert. Unsere Bakterielle Kulturmethode ist ein neues Werkzeug in der Mikrobiologie, um unbekannte Umweltbakterien zu kultivieren, um ihre Stoffwechselprodukte zu erhalten oder zu analysieren.
