Nehmen Sie zunächst elektrisch stimulierte RSC96-Zellen in Kulturschalen ein. Zeichnen Sie dann mit einem Histologiestift Kreise an Stellen, an denen die Zellen gleichmäßig auf dem Deckglas verteilt sind. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Permeabilisierungslösung in die Zellen und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Waschen Sie dann die Zellen dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Fügen Sie dann 3 % BSA in den Kreisen hinzu, um das Gewebe gleichmäßig zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Blockierungslösung und geben Sie den entsprechend verdünnten Primärantikörper in die Zellen.
Stellen Sie die Zellkulturplatte in eine feuchte Box und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Zellen dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS unter ständigem Schütteln. Den entsprechenden Sekundärantikörper zugeben und 50 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Legen Sie am Ende der Inkubation den Deckbezug in PBS und waschen Sie ihn dreimal unter Schütteln für jeweils fünf Minuten. Lassen Sie dann den Objektträger trocknen und fügen Sie dem getrockneten Objektträger DAPI-Färbelösung hinzu. Zum Schluss verschließen Sie den getrockneten Deckglas mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium für die Fluoreszenz.
Erfassen Sie Bilder mit spezifischen Anregungs- und Emissionswellenlängen für Alexa Fluor 488, SCI3 und SCI5. Die mikroskopische Analyse zeigte verstreute zytoplasmatische S-100 beta-positive Zellen in Rot in allen Gruppen, und eine erhöhte integrierte optische Dichte der S-100 beta-Fluoreszenz wurde in der Fünf-Kilovolt-pro-Zentimeter-Gruppe im Vergleich zur Kontroll- und 10-Kilovolt-pro-Zentimeter-Gruppe beobachtet. GFAP- und Sox10-positive Zellen mit verstreutem Zytoplasma wurden in allen Gruppen während der Zellkriechen-Assays beobachtet.
Die GFAP-Expression war jedoch in der Fünf-Kilovolt-pro-Zentimeter-Gruppe signifikant niedriger als in der Kontroll- und der 10-Kilovolt-pro-Zentimeter-Gruppe. RSC96-Zellen in der Gruppe mit fünf Kilovolt pro Zentimeter zeigten einen signifikant höheren mittleren Grauwert der Sox10-Expression, was auf eine verstärkte Sox10-Expression hindeutet.
