This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.

HINWEIS: Alle Experimente mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den britischen Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 durchgeführt. 1. Versuchsaufbau <ol><li> Vor der Gewebe- und Zellernte beginnen, überprüfen Sie, ob alle Werkzeuge sind steril. Ob Bedarf Autoklav ein Paar scharfe chirurgische Scheren, einer sehr feinen Pinzette und einer feinen Pinzette Standard. Auch sterilisieren jedes Substrat vor Zellaussaat mit UV-Entkeimung, Ethanol Exposition oder Dampfsterilisation als angemessen. </li><li> Vorbereitung der Medien für die Stammzellernte und Differenzierung <ol><li> Vorbereiten des Stammzellwachstumsmedium, das Minimum Essential Medium (α-MEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 200 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin (PS) ergänzt. </li><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Forskolin hergestellt, indem 10 mg von Forskolin in 2,436 ml sterilem Dimethyl sulfoxyde. Verwenden Sie in einer Endkonzentration von 14 &amp; mgr; M. &lt;/ Li&gt; <li> Bereiten Sie eine 35 mg / ml Stammlösung von Retinsäure durch Lösen von 50 mg in 1,43 ml sterilem Dimethyl sulfoxyde. Verwenden Sie in einer Endkonzentration von 350 ng / ml. </li><li> Bereiten von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) Bestände (100 ug / ml), die durch Auflösen von 10 ug gefriergetrocknetes Pulver in 100 ul destilliertem sterilem Wasser. Verwenden Sie in einer Endkonzentration von 5 ng / ml. </li><li> Bereiten basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) Bestände (100 ug / ml), die durch Auflösen von 50 ug gefriergetrocknetes Pulver in 500 ul destilliertem sterilem Wasser. Verwenden Sie in einer Endkonzentration von 10 ng / ml. </li><li> Bereiten Sie die Stammzelldifferenzierung Medium, das Stammzellwachstumsmedium mit 14 &amp; mgr; M Forskolin, 126 ng / ml glialen Wachstumsfaktor-2 (GGF-2), 5 ng / ml aus Blutplättchen-stammender Wachstumsfaktor (PDGF) und 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). </li></ol></li><li> Vorbereitung der Medien und der Stammlösungen für Neuron Ernte und Dissoziation <ol><li> Bereiten BottenstEin und Sato (BS) Medium 28, durch Zugabe von 1% PS und 1% N2 Ergänzung zur Ham-F12-Medium. Berechnen das Endvolumen 500 &amp; mgr; l pro Well benötigt (bei Verwendung einer Platte mit 24 Vertiefungen). </li><li> Bereiten Kollagenase IV Bestände in Ham-F12-Medium in einer Konzentration von 1,25% Gew / V. Filter-Sterilisation der Lösung und bei -20 ° C bis zu 200 ul Aliquots. </li><li> Bereiten Rinderpankreas-Trypsin-Aktien in Ham-F12-Medium in einer Konzentration von 2,5% w / v, Filter-sterilisiert und bei -20 ° C bis zu 200 ul Aliquots. </li><li> Vorbereiten der Nervenwachstumsfaktor (NGF) Stammlösung in einer Konzentration von 5 ug / ml in einem sterilfiltrierten 1 mg / ml fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in F12-Medium und bei -20 C zu 200 ul Teilmengen. Die NGF nach Rekonstitution Nicht filtern. </li></ol></li><li> Falls keine Oberflächenmodifikation wurde fällt Deck / Platten mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml durchgeführt für 15 min bei RT) Und / oder Laminin (2-10 &amp; mgr; g / cm 2 für 2 h bei 37 ° C) zu Neuron Befestigung und Neuritenwachstum gegebenenfalls unterstützen. </li><li> Immer aufwärmen Medien in einem Wasserbad bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) Ernte und Differenzierung in einen SC Phänotyp <ol><li> ASC Ernte von viszeralen und Leisten Fett der erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten <ol><li> Vor Anfangs, einen Schlauch mit 10-15 ml Hanks Balanced Salzlösung (HBSS) mit 1% v / v der PS-Lösung und auf Eis aufbewahren, bis Fett Ernte ergänzt. </li><li> Beenden Sie die Ratte durch Genickbruch und Enthauptung. Rasieren Sie die Ratte und einen Einschnitt durch die Bauchhaut, Freilegung der inneren Organe und die Vermeidung von Blutungen. Entfernen Sie das viszerale Fett umhüllt den Magen und Darm (in der Regel gekennzeichnet durch eine Fett gelb Konsistenz) und das Leisten Fett rund um die Hoden von einem erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten. Über the Fett in das Röhrchen mit HBSS auf Eis. </li><li> In einer biologischen Sicherheitswerkbank (Klasse II) fein hacken Fett mit einer Schere und einer sterilen Rasierklinge bis feine Konsistenz erreicht ist und überträgt es in ein Röhrchen mit 15 ml 0,2% w / v Collagenase Typ I-Lösung frisch zubereitet und am Tag filtersterilisiert. </li><li> Übertragen des Rohres in einem Wasserbad bei 37 ° C und lassen das Fettgewebe in Gegenwart des Enzyms für 30 min-1 h unter kontinuierlichem Rühren zu verdauen. Überwachen Sie die Verdauung eng und zu stoppen, bevor das Gewebe vollständig losgelöst ist, wird dies die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellausbeute zu verbessern. Filter Theun-dissoziierten Gewebe durch eine 100 um Zellsieb. HINWEIS: Gute Gewebe Verdauung wird in homogene Konsistenz des Fettes, sichtbar durch das Auge führen, wenn Erwärmung bewegen den Schlauch, den Erwerb einer beige Aussehen. </li><li> Neutralisieren des Enzyms durch Zugabe von 15 ml der Stammzellwachstumsmedium, das fötales Rinderserum bei 37 ° C und die ZentrifugeLösung bei 160 g für 10 min, um das stromale Gefäßanteil, einschließlich der Stammzellen zu sammeln, an der Unterseite des Rohres. </li><li> In diesem Stadium kann das Pellet in 1 ml von roten Blutzellen suspendiert werden Lysepuffer Blutzellkontamination zu entfernen. Nach Resuspension und Pipettieren für 1 min, 10 ml frischer Stammzellwachstumsmedium und Zentrifugation bei 160 g für 10 min. </li><li> Den Überstand vorsichtig absaugen aus der Tube, kümmert sich um die abgeschiedene Zellpellet am Boden. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Stammzellwachstumsmedium, übertragen in einen 75 cm 2 Kolben und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2. Pflegen Sie die Zellen bei subkonfluenten Ebenen bis Passage 1-2, Ändern Medium alle 3 Tage. </li></ol></li><li> ASC Differenzierung zu einer SC-Phänotyp <ol><li> Beim Durchgang 1-2, entfernen Sie die Stammzellwachstumsmedium aus der 75 cm 2-Kolben und ersetzen sie durch 10 ml frisches Medium, das 1 mM β-Mercaptoethanol frisch preparot und am Tag filtersterilisiert. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden. In diesem Stadium ist es wichtig, dass die Zellen bei geringer Dichte (30%) vor dem Beginn der Differenzierung ausgesät. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit HBSS, absaugen und ersetzen Sie es mit 10 ml Medium mit 350 ng / ml Retinsäure. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 72 Stunden. Versuchen Sie, um die Exposition der Zellmedium, um Licht zu minimieren. </li><li> Nach 3 Tagen, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit HBSS, absaugen und ersetzen sie durch 10 ml der Stammzelldifferenzierungsmedium (siehe Schritt 1.2.6). Pflegen Sie die Zellen bei subkonfluenten Ebenen ändern Medium alle 3 Tage. HINWEIS: Nach 2 Wochen nach der Inkubation werden die ASC in SC artigen ASC differenziert, deren charakteristische Phänotyp exprimieren (wie durch Kingham et al 5 gezeigt.). Sie können dann bis zum 10. Durchgang ohne merkliche Veränderungen im Verhalten 29 verwendet werden. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Ernte und Dissoziation von Spinalganglien (DRG) Neuronen <ol><li> Beenden Sie die Ratte durch Genickbruch und Enthauptung. Rasieren Sie die Ratte und heben Sie die Haut, um die Wirbelsäule aus. Mit einer scharfen Schere, excide die Wirbelsäule unter besonderer Vorsicht der begrenzten Organe und Blutgefäße. Übertragen Sie die Wirbelsäule in einer biologischen Sicherheitswerkbank (Klasse II) mit einer Petrischale und jede Rückenteil zu entfernen. </li><li> Teilen Sie die Wirbelsäule in der Mitte entlang der Längsachse mit sterilen und scharfe chirurgische Scheren, die Marksgewebe aus. An diesem Punkt ist es hilfreich, die Wirbelsäule in zwei kleinere Segmente unter dem Niveau des Brustkorbs zu schneiden, zu erleichtern, die während der DRG Neuronen Ernte handhaben. Mit feinen Pinzette vorsichtig entfernen Sie alle Marksgewebe, die Aufmerksamkeit auf nicht ziehen und entfernen Sie die DRG Wurzeln. Auf diese Weise die DRG und Wurzeln werden in den Wirbel Kanälen ausgesetzt werden, noch in die Säule umhüllt. Beachten Sie DRG als weiße Fäden comidirekt ng aus den Kanälen. </li><li> Ziehen Sie die gesamte DRG Wurzel (nicht nur die DRG) von den Wirbel Kanäle durch Verwendung von sehr feinen Pinzette, die tief in die Wirbel Kanäle und die Aufmerksamkeit nicht auf die Wurzeln der Ganglien beschädigen. Übertragen der DRG in eine kleine Petrischale (60 mm 2), die 3-4 ml Ham-F12-Medium mit 1% PS ergänzt. Bei der Verwendung von verschiedenen Tieren, getrennte Küche. </li><li> Unter einem Binokular, reinigen Sie den DRG des Betrags Nervenwurzeln um die Ganglien mit einer sterilen Pinzette und Skalpell zu Gliazellen Verschmutzung zu reduzieren. Übertragen Sie die DRG in eine kleine Petrischale (35 mm 2) mit 1,8 ml frischem F12-Medium. </li><li> Fügen Sie 200 ul von 1,25% Gew / Vol Collagenase Typ IV-Stammlösung (Endkonzentration von 0,125%) und inkubieren Sie die DRG bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1 Stunde. Sorgfältig absaugen Medium mit einer Glaspipette, die Aufmerksamkeit nicht auf absaugen oder die DRG beschädigen. Frisches F12-Medium geschmeidigmentiert mit 0,125% w / v Collagenase Typ IV-Enzym und Inkubation für 1 Stunde wie zuvor beschrieben. </li><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie sich leicht die DRG mit F12-Medium. Hinzufügen dann 1,8 ml F12-Medium und 200 &amp; mgr; l Trypsin (Endkonzentration von 0,25% Gew / V) und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min. </li><li> Entfernen Trypsin und 1 ml F12-Medium mit 500 ul FBS um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Saugen Sie das Medium und waschen Sie sich leicht die DRG mit F12-Medium für drei Mal, um Spuren von Serum zu entfernen. </li><li> 2 ml frischem F12-Medium und sorgfältig überweisen Sie die DRG mit dem Medium in einen 15-ml-Röhrchen mit einer Glaspipette. Vorsichtig distanzieren die DRG-Neuronen durch Auf- und Abpipettieren (ca. 8-10 mal) mit der Glaspipette (Kunststoffspitzen können als Alternative verwendet werden). </li><li> Pellet an am Boden des Röhrchens absetzen und sammeln das Medium in ein neues Röhrchen. 2 ml frischem F12-Medium in das Röhrchen mit dem Pellet und wiederholen Sie den mechanische Dissoziation mit der Glaspipette. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Suspension homogen (etwa 3-4 mal) wird und sammeln Sie alle dissoziierten DRG in die Röhre schieben. Dieses Verfahren reduziert die Belastung, die sich aus dem mechanischen Dissoziation und verbessert die Lebensfähigkeit der Neuronen. </li><li> Filtern Sie die resultierenden homogenisierten Suspension in eine neue 15-ml-Röhrchen mit einem 100 um Zellsieb zu un-dissoziierten Neuronen und andere Verunreinigungen zu entfernen. In diesem Stadium kann es nützlich sein könnte, um zuerst die Zellsuspension Filter in ein 50 ml Röhrchen, und dann wird die Lösung in der kleineren Tube mit einer Glaspipette. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 110 g für 5 min. </li><li> Vorbereiten einer 15% Rinderserumalbumin (BSA) durch Zugabe von 500 ul einer 30% igen BSA-Lösung zu 500 &amp; mgr; l F12-Medium. Langsam Pipette die Lösung auf der Wand einer 15-ml-Röhrchen, um eine allmähliche Protein Spur erstellen. In diesem Stadium ist es hilfreich, das Röhrchen in einem Winkel von 45 ° zu halten und langsam frei die BSA mit den NummernDie Falcon-Röhrchen als Referenz für die Bildung &quot;Spur&quot;. </li><li> Überstand von Schritt 3.10 Abgangs 500 ul an der Unterseite des Rohres und Zellpellet im gleichen Medium. Langsam pipettieren Suspension entlang der Protein Spur zuvor in Schritt 3.11 (mit den Zahlen auf der Röhre als Referenz) und Zentrifugieren bei 500 g für 5 min hergestellt. </li><li> Saugt den Überstand und das Pellet in 1 ml des modifizierten BS Medium (oder einem Mischmedium für die SC-like ASC / DRG Co-Kultur, wie unten in Stufe 4.5 beschrieben. ANMERKUNG: Das Volumen resuspendieren DRG Neuronen bis zu dem tatsächlichen Volumen benötigt werden, abhängig von der gewünschten Endkonzentration an Zellen und der Anzahl der Proben, die geimpft werden. Ein Tier wird genügend Zellen für eine Platte mit 24 Vertiefungen Experiment liefern. </li><li> Die gesetzten Proben bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 Stunden, um die Zellhaftung zu ermöglichen und schließlich fügen Sie frisches BS-Medium mit 50 ng / ml von Nervenwachstums fa ergänztctor (NGF). </li></ol> 4. Die direkten Co-Kultur der SC-ähnliche ASC und DRG-Neuronen <ol><li> Pflegen SC-ähnliche ASC in Kultur bei subkonfluenten Ebenen wie in Schritt 2.2.3 beschrieben. Vierundzwanzig Stunden vor DRG Ernte, saugen Sie den Stammzelldifferenzierungsmedium und waschen Sie die Zellen mit HBSS. Absaugen und inkubiere in 3 ml Trypsin bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 min. </li><li> Prüfen unter einem Lichtmikroskop, dass alle Zellen von dem Kolben abgelöst. Die Flasche klopfen Sie leicht auf Distanz zu helfen. In 7 ml Medium, um das Trypsin Reaktion zu stoppen, sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bei 110 g für 5 min. </li><li> Aspiration des Überstands und Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml Stammzelldifferenzierungsmedium. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt das Zellsuspension nach der Endkonzentration erforderlich. Idealerweise Aussaat 20.000 SC-ähnliche ASC / cm 2 würde eine konfluente Schicht von Zellen zu gewährleisten. </li><li> Samen der SC-likeASC auf dem Substrat und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 h auf die Zellbindung zu ermöglichen. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, saugen Sie den mittleren und fügen Sie die DRG-Neuronen auf der Oberseite der Zellen wie in Schritt 3.14 und 3.15 beschrieben. Ändern des Mediums, um ein gemischtes Medium, das 50% der Stammzelldifferenzierungsmedium und 50% der BS Medium. Darüber hinaus reduziert die FBS-Konzentration auf 1 bis 2,5% in der letzten Mischmedium hilft Vermeidung der Verbreitung der Kontamination Satellitenzellen aus dem DRG Dissoziation abgeleitet. </li><li> Die co-kultivierten Proben bei 37 ° C, 5% CO 2 und aufrechtzuerhalten in der Kultur für die erforderliche Zeit für zukünftige Tests. </li></ol>

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T., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+adipose+tissue+engineering.">Stem cells and adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).</li><li>Bottenstein, J. E., Sato, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+rat+neuroblastoma+cell+line+in+serum-free+supplemented+medium.">Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).</li><li>Mantovani, C., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+molecular+and+functional+differences+of+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+stem+cells+isolated+from+rats+of+different+ages.">Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages.</a> Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).</li><li>Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+adipose-derived+stem+cells+act+synergistically+with+RGD-modi+fi+ed+surfaces+to+improve+neurite+outgrowth+in+a+co-culture+model.">Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Molecules+Enhance+the+Neurotrophic+Effect+of+Schwann+Cell-Like+Differentiated.">Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated.</a> Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).</li><li>Fudge, N. J., Mearow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-associated+gene+expression+in+adult+sensory+neuron+populations+cultured+on+a+laminin+substrate.">Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate.</a> BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).</li><li>Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+rigidity+and+ligand+density+influence+neuronal+response+in+methylcellulose-laminin+hydrogels.">Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels.</a> Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).</li><li>Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21:+Use+of+stem+cells+for+improving+nerve+regeneration.">Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration.</a> Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).</li><li>Richardson, J. a., Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+dorsal+root+ganglion+neurites+and+Schwann+cells+by+isolated+Schwann+cell+topography+on+poly(dimethyl+siloxane)+conduits+and+films.">Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).</li><li>Seggio, a. M., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth.">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).</li><li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules.">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li><li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth.">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li></ol>

The authors confirm that there are no conflicts of interest associated with this publication.

DRG Neuronen häufig bei neuronalen Zellen zur Kultivierung, um die Regeneration von Neuronen nach Axotomie in vivo zu studieren. Hier ein genaues Protokoll für DRG Ernte von erwachsenen Ratten vorgelegt wird, auf eine Verringerung der Bevölkerung von Satelliten-Zellen in die Umgebung, ohne die das neuronale Überleben ab. Als ASC in einen SC-ähnlichen Phänotyp differenziert sind eine gute Alternative zum SC für Zelltherapien wird ein SC-ähnliche ASC / DRG-Co-Kultursystem auch im Detail beschrieben. Es ist weithin bekannt, daß Laminin (oder Laminin abgeleiteten Peptidsequenzen) eine vorteilhafte Wirkung auf das Überleben von Neuronen und Neuritenbildung 31-33. Bei der Durchführung von DRG Neuronenkulturen wird somit zuvor Mantel jedes Substrat mit Laminin, um jeglichen Verlust von Funktionalität der neuronalen Zellen verhindern raten. Das Konzept von Laminin Beschichtungen gilt auch für Biomaterial Substrate für das Design vonTissue Engineering-Konstrukte, wie beispielsweise Poly - Caprolacton (PCL), die häufig zur Herstellung von Nervenleitungen 30 verwendet. Auch zeigte früheren Arbeiten, dass Fibrin-Matrizen sind geeignete Materialien für die neuronalen Kulturen in drei Dimension 11. Neben Proteinbeschichtung, Co-Kulturmodellen wertvolle Bedingungen für DRG Überleben von Neuronen und eine geeignete Umgebung für die Interaktionen, die zwischen den Neuronen und SC in das periphere Nervensystem nach Verletzungen auftreten, zu untersuchen. Zellen können auch in vivo unter Verwendung von neuronalen Einrichtungen, um die Einstellungszeit von autologen Zellen an der Verletzungsstelle zu verkürzen transplantiert werden. Dies ist besonders wichtig bei schweren Verletzungen, die Zellalterung / Tod und Muskelschwund führen kann. Obwohl SC sind die wichtigsten Gliazellen in den Prozess der Regeneration peripherer Nerven und Myelinisierung, ihre begrenzte Verfügbarkeit und ihre langsame Proliferationsrate beteiligt macht sie ungeeignetTissue Engineering-Anwendungen 34. ASC sind eine gute Alternative aufgrund ihrer Vielfalt und der Fähigkeit, in die SC-Phänotyp zu differenzieren, Expression spezifischer Glia-Marker und zeigen funktionale Ähnlichkeiten mit einheimischen SC 19. ASC sind ebenfalls in der Lage, Proteine ​​und Wachstumsfaktoren, 5, die vorteilhaft für die Bildung und Verlängerung der Neuriten von DRG-Neuronen in einer Co-Kultur-System erzeugen kann. Jedoch können zwei verschiedene Co-Kultur-Systeme als Funktion der experimentellen Anforderungen eingestellt werden. Die in diesem Papier vorgeschlagenen Verfahren ist eine überarbeitete Version eines etablierten Protokolls in unserem Labor 11 und es einen direkten Kontakt zwischen den beiden Zelltypen (direkte Co-Kultur), in der der zweite Zelltyp (DRG-Neuronen) ausgesät werden beinhaltet auf der Oberseite der anderen (SC-ähnliche ASC). Dieser Ansatz basiert auf früheren Befunden, die die Wichtigkeit der Anwesenheit einer glialen Zellschicht auf dem Substrat gezeigt, wenn Impfen neuronalen Kulturen 35 basierend <sup&gt; - 37. Diese Wirkung ist wahrscheinlich auf die Zell-Zell-Wechselwirkungen durch DRG Integrinen und ECM-Moleküle aus ASC und andere Signale auf dem Stammzellen Oberfläche abgeschieden. Es wurde auch beobachtet, dass eine Reduzierung der Serumproteinen im Medium verringert die Vermehrung von kontaminierenden Satellitenzellen, die aus der Dissoziation von DRG Neuronen leiten kann, ohne dass dies Auswirkungen ASC Funktionen. Jedoch Satellitenzellen, einschließlich einer kleinen Population von SC, sind schwer vollständig beseitigen aus Kulturen von DRG-Neuronen und einigen restlichen Zellen werden auch in dem Co-Kultursystem vorhanden sein. Daher ist es wichtig zu beachten, dass diese kleinen Subpopulationen kann auch auf die Myelinisierung Prozesse bei in vitro-Studien teilnehmen, unter Hinweis auf die autologen Zellen, die in vivo nach Verletzungen vorhanden sind. Der zweite Ansatz (hier nicht dargestellt) umfasst die Verwendung von Zellkultureinsätzen, die Vermeidung eines direkten Kontakts zwischen den beiden verschiedenen Zelltypen (indirekte Kokultur). However ist nicht repräsentativ für die in-vivo-Bedingungen bei der Nervenregeneration (reduzierte Fähigkeit von neuronalen Zellen, lange Neuriten zu entwickeln), wird jedoch verwendet, um die Wirkung des freigesetzten diffundierbaren Faktoren im Medium durch eine bestimmte Zellpopulation auf die anderen 38 zu untersuchen .

Periphere Nervenverletzungen sind häufig mit rund 9.000 Fälle im Vereinigten Königreich jedes Jahr auftreten in einem überwiegend jungen und arbeitenden Bevölkerung ein. Trotz mikrochirurgische Nervenreparaturverfahren, ist normal, Wiederherstellung der Funktion unerreichbar mit resultierenden beeinträchtigt Handgefühl, reduzierte Motorik und häufige Schmerzen und Kälteempfindlichkeit 2. Solche Verletzungen haben eine tiefe und dauerhafte Auswirkungen auf die Patienten und ihre Fähigkeit, Aktivitäten des täglichen Lebens durchzuführen, mit der Rückkehr weniger als 60% zu arbeiten 3. Nach Verletzung, den Phänotyp und die Morphologie von Neuronen und Schwann-Zellen (SC) sich verändern, um eine geeignete Umgebung für das Axon Keimen ermöglichen erstellen. Im Falle der Durchtrennung wird der Nerv in proximalen und distalen Stümpfen unterteilt; die proximalen Stumpf der Punkt, von dem die Regenerationsprozess stattfindet, während die distalen Stumpf erfährt Waller-Degeneration woraufhin der SC detachvon den verletzten Axone, de-differenzieren und sich vermehren. Dies ist von grundlegender Bedeutung zur Beseitigung Myelin Trümmer und die Vorbereitung des distalen Stumpf für Nervenwieder Generation 4,5. Axon Keimen wird durch die Produktion von neurotrophen Faktoren und Chemokine durch SC an dem distalen Stumpf Freigabe gehalten und durch die Basallamina hinter folgenden Waller-Degeneration 6,7 links geführt. SC ausrichten neben der regenerierenden Axone bilden die Bande des Büngner, welche Hilfe das Wachstum von Axonen in Richtung des Zielorgan, die Verringerung Verzweigung außerhalb des endoneuralen Rohr. Nach Reinnervation, SC bilden die neue Myelinscheide Einwickeln der regenerierten Axone, aber sensorischen und motorischen Funktion wird nur teilweise restauriert 8. Dorsalwurzelganglien (DRG) sind Strukturen in der Zwischenwirbellöcher der Wirbelsäule befindet, enthält die sensorischen Nervenzellen innervieren die peripheren Organe. Wenn dissoziiert sind, können sie als eine geeignete in vitro mod verwendet werdenel für die Untersuchung der Nervenregeneration 9-11, einschließlich Untersuchungen der Myelinbildung. Insbesondere Erwachsenen DRG-Neuronen imitieren die in vivo Eigenschaften dieser Zellen und eine hervorragendes Instrument, um neue Strategien für die peripheren Nervenreparatur im Tissue Engineering zu studieren. Co-Kulturen stellen ein dynamisches System, das in vitro die Wechselwirkung von zwei (oder mehr) Zelltypen in einem bestimmten in vivo-Umgebung simuliert. Einer der Vorteile dieser Zell Kokultur Modelle ist die Flexibilität und Kontrolle, die für die extrazelluläre Umgebung ausgeübt werden können. DRG-Neuronen wurden häufig in Co-Kultur-Systeme mit SC verwendet, um die Ist-Wechselwirkungen, die zwischen den beiden Zelltypen in dem peripheren Nervensystem auftreten, nachahmen 10,12 - 14. Es wurde gezeigt, dass SC sezerextrazellulären Matrix (ECM), Proteine ​​und Wachstumsfaktoren, die bemerkenswert verbessern kann, dieFähigkeit des DRG-Neuronen zu überleben und sprießen Neuriten 15,16. , SC erfordern jedoch längere Zeit zu proliferieren und trotz der Fortschritte in der Zellkulturtechnik ist es immer noch schwierig, eine geeignete Anzahl von Zellen für das Tissue Engineering-Anwendungen zu erzeugen. Darüber hinaus ist das Opfer eines gesunden Nerven notwendig, um autologe SC ernten. Daher ist der Unterschied in der Beschaffung SC wichtig sowohl für das Tissue Engineering und in vitro-Tests der Nervenregeneration. In dieser Ansicht kann ASC als eine wertvolle Alternative für die Entwicklung einer Gewebe-manipulierten Konstrukts für periphere Nervenreparatur 17,18 verwendet werden kann. Frühere Arbeiten zeigten die Fähigkeit dieser Zellen in SC artigen ASC Differenzierung exprimieren Kenn glial-Marker, wie S-100, p75 und gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) 19, sowie die Myelin-Hauptprotein Null (P0) 20 . Die Sekretion von Glia-Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF), war Nervenwachstumsfaktor (NGF) und von Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) beobachtet 21,22. Daher kann SC artigen ASC als Promotor von peripheren Nervenregeneration verwendet werden, wie durch in vitro nachgewiesen und in vivo Studien 23-26. Zusätzlich kann ASC durch minimal-invasive Verfahren in höherer Anzahl im Vergleich zu anderen Stammzelltypen gewonnen werden; die Frequenz der Stammzellen im Fettgewebe ist 100- bis 1000-fach höher als im Knochenmark 27, und sie haben eine höhere Proliferationsrate als SC und dem Knochenmark mesenchymale Stammzellen sind. Diese Arbeit soll ein detailliertes Protokoll zur hocheffizienten Ernten von dissoziierten DRG Neuronen und ASC bzw. durchzuführen, wobei die letztere in SC-ähnliche Zellen differenziert werden. Die Co-Kultur dieser beiden Zelltypen die daher ein sehr praktisches System, das zu weiteren Untersuchungen auf die Fähigkeit von DRG ne verwendet werden kann,Urone um Neuriten und die Mechanismen der Myelinbildung auf verschiedenen Gerüst für Nervengewebe Technik sprießen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">100 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:116px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;">70 &#956;m strainers (ref. 352350) can be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">15 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">50 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.547.004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">75 cm2 flasks</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">BC301</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Retinoic Acid &#62;98% HPLC</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">ARA-C supplement</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6645</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic (154 aa)</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9205</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Collagenase type I</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:167px;">Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:216px;">Collagenase type IV</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">LS004188</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:119px;">FB-1001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Forskolin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB50253</td>
			<td style="width:167px;">Sharp material to be disposed accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:216px;">Glial Growth Factor-2 (GGF-2)</td>
			<td style="width:116px;">Acorda Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-&#946;1 (R &#38; D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nutrient Mix F12 HAM</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6658</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">N-2 supplement (100x)</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands&#160; (NGF)</td>
			<td style="width:116px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">NC011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Recombinant Human PDGF-AA</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-13A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin (2x bovine pancreatic)</td>
			<td style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003703</td>
			<td style="width:167px;">This is used for DRG dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;">Prepare the solution in the biological cabinet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Kulturen von dissoziierten DRG Neuronen dar zur Untersuchung der Nervenregeneration eine geeignete in vitro-Modell. Allerdings sind unbehandelte Substrate keine geeignete Umgebung für die DRG-Befestigung und Verlängerung von Neuriten. SC artigen ASC können Wachstumsfaktoren und Chemokinen 19, der die Fähigkeit von DRG Neuronen Neuriten keimen verbessern kann, wenn sie in das Kulturmedium freigesetzt herzustellen. Die Anwesenheit von SC artigen ASC in dem Kultursystem kann daher eine wichtige Rolle bei der Regulierung der DRG-Funktionen. Dieses Protokoll (Bild 1) zeigt die Vorgehensweise, um eine direkte Ko-Kultur von SC artigen ASC und DRG-Neuronen, während der neuronalen Zellen in direktem Kontakt mit zuvor ausgesät SC artigen ASC erhalten auszuführen. Das Hauptproblem bei diesem Verfahren ist der hohe Variabilität der Anzahl von DRG-Neuronen von unterschiedlichen Tieren geerntet. Aus diesem Grund können die Ergebnisse manchmal schwierig sein, Compare und eine besondere Aufmerksamkeit während der Saatfahrweise, um stets eine vergleichbare Zelldichte in jedem Experiment erhalten gezahlt. Das Protokoll wurde optimiert, um zumindest die Anzahl von Satellitenzellen von DRG Neuronen Dissoziation unter Verwendung der BSA-Gradienten (Schritt 3.11) verbleibenden reduzieren. Zusätzlich kann Cytosin-Arabinose (ARA-C) Ergänzung des BS Mediums, um den Satelliten-Zellpopulation weiter zu minimieren hinzugefügt werden, wie durch Kingham et al. 11 beschrieben. Die Auswahl der Behandlungszeit muss jedoch sorgfältig gegen das DRG und SC artigen ASC Vitalität, auch durch die Gegenwart von Ara-C Zusatz im Kulturmedium beeinflusst zu sein. Daher ist es sehr schwer, eine Satellitenzelle freiSystem zu erreichen. Bild 2 zeigt die Bedeutung der SC artigen ASC für DRG Neuriten Sprießen in einem Co-Kulturmodell unter Verwendung von unbehandeltem und chemisch modifizierten Poly - Caprolacton (PCL) Folien als Substrate. DRG-Neuronen waren maiin Kultur ntained für 3 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von SC artigen ASC, unter Verwendung einer gemischten Lösung, die 50% der BS Medium und 50% der Stammzelldifferenzierungsmedium, wie in Schritt 4.5 beschrieben. Nach diesem Zeitraum wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit β-Tubulin III (DRG Neuronen) und S100 (SC artigen ASC), um die Zellmorphologie zu untersuchen und um die Fähigkeit von DRG Neuronen Neuriten ragen studieren gefärbt. Keine Neuriten wurden auf unbehandelten Oberflächen in Abwesenheit von SC artigen ASC (2A) beobachtet, während die Bildung von Neuriten wurde eindeutig im Co-Kultursystem (2C) verbessert. Im Durchschnitt beträgt die Anzahl von Neuriten pro Zelle Körper deutlich von 0 bis 3 in Gegenwart von Stammzellen gesteigert. Eine Bestätigung dieser Ergebnisse wurde auch durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) -Analyse, in 3 gezeigt angegeben. Insbesondere sind die SEM-Bilder zeigen, dass die Fähigkeit von DRG Neuronen Neuriten keimen läuft bevorzugt in Verbindungmit SC artigen ASC, wie durch die gelbe Pfeile in Figur 3C dargestellt. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Verwendung von Laminin-modifizierte Substrate (einschließlich Laminin abgeleiteten Peptiden) in Kultursystemen, die DRG-Neuronen wurde häufig als ein geeigneter Zustand für neuronale Zellkultur definiert, mit bemerkenswerten Wirkungen auf Neuritenbildung und Verlängerungs 30-32 . Die in 2D und 3D gezeigt Ergebnisse haben jedoch gezeigt, daß die Kombination von chemischer und biologischer Signale können weiter die Reaktion der DRG-Neuronen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Herstellung der direkten DRG-SC artigen ASC Co-Kultursystem. DRG Neuronen und ASC werden jeweils von der Wirbelsäule und dem viszeralen Fett und inguinalen adulter mal abgeleitetene Sprague-Dawley-Ratten. Nach der Verdauung des Fettgewebes durch eine Kaskade von enzymatischen Reaktionen sind ASC in SC-ähnliche Zellen differenziert und in subkonfluenten Bedingungen gehalten, bis sie benötigt. SC-ähnliche ASC sind bereits ausgesät auf jedem Substrat 24 Stunden vor der DRG Ernte. Am Tag werden DRG Neuronen extrahiert und dissoziiert durch eine Reihe von enzymatischen und mechanischen Einwirkungen. Die Nervenzellen werden dann auf der Oberseite der zuvor ausgesät SC-ähnliche ASC ausgesät und in Kultur gehalten bis zur Analyse (Mischmedium: das 50% der Stammzelldifferenzierungsmedium und 50% der modifizierten BS Medium). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Fluoreszenzbilder von DRG-Neuronen in verschiedenen Kulturbedingungen.(A) unbehandelte PCL Folien; (B) RGD-modifizierten PCL Folien; (C) co-kultiviert mit SC-ähnliche ASC auf unbehandelten PCL Folien; (D) co-kultiviert mit SC-ähnliche ASC auf RGD-modifizierten PCL-Filme. Zellen wurden in Kultur für 3 Tage unter Verwendung einer gemischten Lösung, die 50% der modifizierten BS Medium und 50% der Stammzelldifferenzierungsmedium gehalten. Nach dieser Zeit wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert, in einem Triton-X-Lösung permeabilisiert, und unspezifische Bindungsstellen wurden mit 1% BSA blockiert. Und SC-ähnliche ASC gegen S-100 (AlexaFluor568; rot) Antikörper; neuronalen Zellen wurden dann gegen β-Tubulin-III (grüne FITC) gefärbt. Schließlich Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX60, Japan) erworben. (Re-Print mit Genehmigung von De Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere vers anzeigen</a>Ionen dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. REM-Aufnahmen von DRG-Neuronen in unterschiedlichen Kulturbedingungen (A) unbehandelte PCL-Filme (B) RGD-modifizierten PCL Folien;. (C) co-kultiviert mit SC-ähnliche ASC auf unbehandelten PCL Folien; (D) co-kultiviert mit SC-ähnliche ASC auf RGD-modifizierten PCL-Filme. Die gelben Pfeile zeigen die Kontaktpunkte zwischen SC artigen ASC und DRG, bestätigt ihre direkte Wechselwirkung in dem Co-Kultursystem. Zellen wurden in Kultur für 3 Tage gehalten und in 2,5% Glutaraldehyd fixiert. Nach Dehydratation in abgestuften Ethanolreihe (50%, 70%, 90%, 100%) wurden die Zellen schließlich in Hexamethyldisilazan ausgespült und vor der Montage auf Stubs und Gold Sputtern für die SEM-Analyse getrocknet. Bilder wurden unter Verwendung eines SEM (Zeiss EVO60, UK) mit einer Beschleunigungs vol erworbenentage von 10 kV. (Re-Print mit Genehmigung von De Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

21.1K Aufrufe.  EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI.  Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle. 

Serie: Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...