Zu Beginn erhalten Sie 250 Milligramm SAT oberhalb des Brustmuskels während der CIED-Implantation in einer magnetisch aktivierten Zellsortier-Gewebeaufbewahrungslösung. Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase/Dispase in 10 Millilitern kalter Hanks'Balanced Salt Solution vor. Unter einem Laminar-Flow-Schrank das Gewebe in 500 Mikroliter Kollagenase/Dispase-Lösung in ein Kubikmillimeter große Stücke zerkleinern.
Geben Sie 4,5 Milliliter der Kollagenase/Dispase-Lösung in die Mischung und geben Sie das verreibte Gewebe in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Deckel der Petrischale mit fünf Millilitern Kollagenase/Dispase-Lösung und geben Sie sie in das Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Röhrchenrotator, der auf 20 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.
Um die Verdauung zu stoppen, gießen Sie 10 Milliliter vollständiges Endothelzellwachstumsmedium in das Röhrchen. Nachdem Sie die verdaute Mischung mit einer 14-Gauge-Venflon-Kanüle verzerrt haben, seihen Sie sie durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb und spülen Sie sie mit 10 Millilitern 0,5 % PBS-BSA-Puffer ab. Das Filtrat wird bei 300 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
Um die abgestorbenen Zellen zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter Kügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen zu dem Zellpellet, das in einem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen wird, und inkubieren Sie. Befestigen Sie dann eine Flüssigkeitsabscheidesäule mit einem 30-Mikrometer-Filter an dem Separatormagneten und platzieren Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen darunter. Nachdem Sie die Säule mit einem Bindungspuffer zur Entfernung toter Zellen gewaschen haben, fügen Sie die Probenperlensuspension hinzu.
Lassen Sie es unter der Schwerkraft passieren und sammeln Sie das Eluat. Als nächstes drehen Sie das gesammelte lebende Zelleluat und resuspendieren das resultierende Pellet in 400 Mikrolitern 0,5 % PBS-BSA. Inkubieren Sie die suspendierten Zellen mit 20 Mikrolitern anti-CD31-beschichteten magnetischen Kügelchen bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Nach dem Zentrifugieren wird das Küvettenpellet in 500 Mikrolitern 0,5 %PBS-BSA resuspendiert. Befestigen Sie eine Säule mit einem 30-Mikrometer-Filter an dem Separatormagneten und platzieren Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen darunter. Geben Sie die Zellmikrokügelchensuspension in die Säule und lassen Sie sie unter der Schwerkraft passieren.
Legen Sie die Säule nach dem Waschen in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie einen Milliliter 0,5 % PBS-BSA in die Säule. Drücken Sie den Säulenkolben, um die CD31-positive Fraktion aufzufangen. Zentrifugieren Sie die Probe wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vollständigem mikrovaskulärem Endothelzellwachstumsmedium.
Geben Sie die Suspension in zwei Vertiefungen einer mit 2 %ige Gelatine beschichteten 24-Well-Platte. Kultivieren Sie die Zellen zwei bis vier Wochen lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen zu fast 80 % zusammenfließen.
