Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus. Und die Suche nach einem geeigneten Standort für die Letentransplantation läuft. Die Islet-Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe ist eine einfache, aber wirksame Methode, die klinische Implikationen haben kann.
Die Extrapolation dieses Verfahrens auf die Klinik kann zur Entwicklung einer Heilung für Typ-I-Diabetiker führen. Diese Methode könnte Einblicke in die klinische Islettransplantation geben, da die Lingual als kein idealer Ort für die Transplantation von Isleten bestimmt wurde. Es ist wichtig, sorgfältig jeden Schritt des Verfahrens zu folgen, insbesondere wichtige Schritte, wie die Pankreasverdauung.
Visuelle Demonstration wird Forschern helfen, die mit der Technik neu zu finden sind, um besser zu bestimmen, wie die Isolierung der Kleinen und die Transmutation durchgeführt werden. Für die Inselernte zuerst das Fell einer 10 Wochen alten C57 black six mouse mit 75% Ethanol besprühen und eine Fünf-Milliliter-Spritze mit frisch zubereiteter Kollagennaselösung füllen. Rüsten Sie die Spritze mit einer 32-Spur-Biegestumpf-Spitzen-Perfusionsnadel aus, und legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem Eisbeutel.
Verwenden Sie gerade spitze Augenscheren, um eine Queröffnung in der Haut des Schambereichs zu machen, und erweitern Sie den Schnitt in Richtung des Kopfes des Tieres. Öffnen Sie den Bauch vollständig über einen V-Inzis aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess, und bewegen Sie die Leber, um die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs freizulegen. Dann verwenden Sie eine Gefäßklemme, um die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs zu schließen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase zu schneiden.
Den gemeinsamen Gallengang durch die Öffnung mit der zuvor vorbereiteten Perfusionsnadel zu nulaten und etwa zwei Milliliter Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse zu injizieren. Wenn die gesamte Kollagenase geliefert wurde, verwenden Sie zwei Paare von nichtinvasiven Mikro-Pinzetten, um die durchgeflossene Bauchspeicheldrüse von Darm, Magen und Milz zu trennen und die Bauchspeicheldrüse in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis zu legen. Wenn alle Proben gesammelt wurden, fügen Sie 100 Mikroliter Dnase I pro Bauchspeicheldrüse zu den 50 Milliliter-Röhren hinzu und schütteln Sie jede Röhre etwa 40 Mal über einen Zeitraum von 10 Sekunden kräftig, bevor Sie das Gewebe drei bis fünf Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad mit moderatem Schütteln legen.
Am Ende der Inkubation, addieren Sie sich zu einem endgültigen Volumen von 50 Milliliter Stop Solution, um die Verdauung zu stoppen. Und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 mal G bei vier Grad Celsius, bevor sie die Zentrifuge schnell stoppen. Nach dem Wegwerfen der Überstände die Pellets zweimal in 15 bis 25 Milliliter Stop Solution pro Wäsche unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen waschen, wie soeben gezeigt.
Nach der zweiten Wäsche drei Pellets pro Rohr in neue 50 Milliliter konische Röhren bündeln. Und setzen Sie die Bauchspeicheldrüsenzellen in einem Gesamtvolumen von zehn Millilitern Histopaque 1119 wieder aus. Als nächstes vorsichtig fünf Milliliter Histopaque 1077 an der Seite jeder Röhre hinzufügen, gefolgt von fünf Milliliter HBSS.
Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pasteur-Pipette, um die Inselchen von der HBSS Histopaque 1077 Schnittstelle zu sammeln. Die Inselchen in einem neuen 50-Milliliter-Konusrohr in einem Endvolumen von 50 Millilitern Stop Solution für die Pulszentrifugation bündeln und den Überstand entsorgen. Das Pellet in 30 Milliliterfrischer Stop-Lösung für eine einminütige Zentrifugation wieder aufhängen und die Inselchen in 30 MilliliterKulturmedium wieder aufhängen.
Dekantisieren Sie die Inselchen in eine 10 Zentimeter lichtdichte Kulturschale pro Röhre. Und legen Sie die Schale unter das Stereomikroskop. Mit 200 Mikroliter-Gel-Ladepipettenspitzen, von Hand wählen Sie die weißen sphäroidalen Inselchen aus der Lösung.
Legen Sie die Inselchen in eine unbehandelte Zellkulturschale mit 10 Milliliter Kulturmedium, wie sie geerntet werden. Überprüfen Sie die Reinheit der handgepflückten Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop. Und die Lebensfähigkeit der Inseln durch Fluorescein-Diacetat propidium iodid färbung unter einem Floreszenzmikroskop erkennen.
Dann kulturieren Die isolierten Inselchen in frischem Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in 95% Luft und 5% Kohlendioxid bis zur Transplantation. Beginnend an den Tagen drei und vier nach der Diabetes-Induktion, punktieren Sie die kaudale Vene jedes Streptozotocin-injizierten acht Wochen alten männlichen C57 schwarz sechs Maus um 10:00 a.m. um eine Blutprobe von jedem EmpfängerTier zu sammeln.
Verwenden Sie ein grundlegendes Blutzuckermessgerät, um den nicht fastenden Blutzuckerspiegel jeder Maus zu bestimmen und fügen Sie das Blut dann auf einzelne Teststreifen. Wenn ein Tier zwei Tage hintereinander einen Blutzuckerspiegel von mindestens 20 Millimole pro Liter nachgewiesen hat, wiegen und markieren Sie die Empfängermaus und bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe bei den anästhesierten Tieren. Legen Sie ein Aliquot von Hydrogel von minus 20 Grad Celsius Lagerung auf Eis zum Auftauen.
Und übertragen Sie 450 bis 500 Islet-Äquivalente pro Empfänger in ein steriles 1,5 Milliliter-Zenififugenrohr mit 200 Mikrolitern Medium pro Tube auf Eis. Den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol abwischen und die Maus in die Supine-Position stellen. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband, und verwenden Sie Clipper, um das Haar um die chirurgische Stelle zu entfernen.
Den Operationsbereich mit Iodophor abwischen und einen vertikalen Schnitt in der desinfizierten Haut machen. Identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene innerhalb des ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen. Sedimentieren Sie die Inseln durch Zentrifugation und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.
Fügen Sie 20 Mikroliter aufgetautes Hydrogel in jedes Rohr, und halten Sie die Inselchen vorsichtig wieder auf, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn eine homogene Suspension erhalten wurde, verwenden Sie eine 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die gesamte Islet Hydrogelmischung vorsichtig aus einem Rohr in die Tasche zu liefern. Wenn das Hydrogel vollständig verfestigt ist, fügen Sie 20 Mikroliter Cephalosporin an die Transplantationsstelle und schließen Sie den Muskel und die Haut mit einer kontinuierlichen chirurgischen Naht von 5-0.
Legen Sie den Empfänger dann in einen sauberen Käfig auf einem Thermopad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Nach der murinen Inselverarbeitung, wie gezeigt, sind die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation. Für die Transplantation sollten nur isolierte Inselchen mit hoher Lebensfähigkeit verwendet werden.
Nach gründlichem Mischen der Islettransplantate mit Hydrogel kann das Transplantat in die ISWAT-Stelle implantiert werden. Nach etwa einem Monat Transplantation in die ISWAT kehren die Islettransplantate die Hyperglykämie um, während das Körpergewicht der Empfängermäuse allmählich zunimmt. Nach 100 Tagen nach der Transplantation führt die Entfernung der Transplantate zu einer sofortigen Erhöhung der 10:00 a.m.
nicht fastenden Blutzuckerspiegel. Histologische Analysen zu diesem Zeitpunkt zeigen, dass die Islettransplantate intakt geblieben sind. Und Insulin und Glucagon immunfluoreszierende Färbung zeigen, dass die transplantierten Inseln auch an 100 Tagen nach der Transplantation funktionsfähig sind.
Achten Sie darauf, die profused Bauchspeicheldrüsenzellen nicht zu robust zu schütteln, sonst wird die Fähigkeit der erhaltenen Inseln beeinträchtigt. Isolierte Inselchen können unter der Nierenkapsel als Kontrolle transplantiert werden, um die Auswirkungen der isolierten Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe an der Stelle zu vergleichen. Das Verfahren wird die Einleitung klinischer Studien zur Letztransplantation an anderen Stellen außer der Leber hinzufügen.
