Wir möchten danken J. van de Steuervermeidung und M. Vroomen (Universität Maastricht, Niederlande), für die technische Unterstützung. Darüber hinaus möchten wir K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, danken und E. Blaak für die Bereitstellung von Blut und Gewebe-Biopsien zum Einrichten dieses Protokolls und der nachfolgenden Experimente verwendet.

Themen, die in die Studie genehmigt von der medizinischen Ethik Komitee Jessa Krankenhaus, Hasselt und Universität Hasselt, Belgien in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgenommen wurden viszeralen und subkutanen Proben entnommen.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Kollagenase-Lösung<ol>
<li>Lösen Sie 1 g der Kollagenbildung zwischengespeichert ich in 10 mL von Phosphat Kochsalzlösung (PBS, ohne Calcium und Magnesium) um eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Lösen Sie 1 g von Kollagenase XI in 10 mL PBS eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Auflösen von 10 mg der DNase I 10 mL PBS eine 10 mg/mL Stammlösung zu machen. Bereiten Sie 180 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 µL Collagenase I (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) und 90 µL DNase I (10 mg/mL) bis 10 mL DMEM Schinken F12. Machen Sie Kollagenase-Lösung für jede Isolierung frisch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erythrozyten-Lyse-Puffer<ol>
<li>0,84 g NH4Cl in 100 mL hochreines Wasser auflösen.</li>
		<li>Den pH auf 7,4 vor Gebrauch festgelegt. In einem Glaskolben bei 4 ° c lagern</li>
		<li>Ort der Erythrozyten Lyse Puffer auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS-Puffer<ol>
<li>Auflösen von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 100 mL PBS, 0,5 % BSA PBS zu erhalten.</li>
		<li>Auflösen von 65 mg NaN3 in 100 mL 0,5 % BSA PBS 10 mM NaN3 0,5 % BSA PBS zu erhalten. Store-Lösung in einem Glaskolben bei 4 ° C.</li>
		<li>Ort FACS-Puffer auf dem Eis vor Gebrauch. Achtung: NaN3 ist hochgiftig. Arbeiten in einer Dampfhaube und Schutzbrille und Handschuhe zum Schutz beim Umgang mit NaN3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschliche IgG-block<ol>
<li>Lösen Sie 10 mg von menschlichen IgG in 10 mL PBS, 1 mg/mL zu erhalten. 100 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Platzieren Sie den menschliche IgG-Block auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung des SVF von AT
<ol><li>Kleinschneiden Sie 1 g bei Biopsie (± 2 mm2) mit einem Skalpell und Transfer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen (z.B. Falcon-Röhrchen). 10 mL Kollagenase Lösung zu jedem Beispiel zugeben. Hinweis: Schließen Sie den Deckel des Rohres vollständig und drehen Sie den Deckel ¼ Umdrehung zurück.</li>
	<li>Inkubation für 60 min bei 37 ° C in einem Wasserbad unter sanft schütteln (60 Zyklen/Min.).</li>
	<li>Filtern Sie die entstandene Suspension mit einem 200 µM-Filter und sammeln Sie die Probe in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 7 mL PBS auf den Filter zu spülen den Filter alle Zellen hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die schwimmenden Adipocyte Bruchteil durch pipettieren. Die Zelle-Kugel ist der SVF. Hinweis: Entfernen Sie den Adipocyte Bruchteil um SVF zu erhalten. Vermeiden Sie die gesamte Spitze der Stichprobe untertauchen, weil dadurch nur der PBS und nicht die schwimmenden Fettzellen entfernt werden.</li>
	<li>Aufschwemmen der SVF in 5 mL PBS Kollagenase zu entfernen, die Aufhängung mit einem 70 µM-Filter filtern, spülen den Filter mit 5 mL PBS und Zentrifugieren der Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und das Pellet in 3 mL Erythrozyten Lyse Puffer Aufschwemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min auf Eis. 7 mL PBS nach Inkubation hinzugeben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
</ol>3. Färbung des SVF für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Auflösen der Zelle Pellet in 90 µL 4 ° C FACS Puffer und 10 µL 1 mg/mL menschliche IgG-Block hinzufügen. Teilen Sie die Zellsuspension in 2 Brunnen eine V-Form 96-well-Platte. Die Platte auf dem Eis und lassen Sie die menschliche IgG-Block für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Jede Probe zu waschen und die Platte für 5 min bei 280 X g bei 4 ° c zentrifugiert fügen Sie 100 µL FACS Puffer hinzu Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf dem Kopf stehend in einer fließenden Bewegung ohne Tippen auf die Platte zu entfernen. Hinweis: Stellen Sie sicher, jede restliche Flüssigkeit von der Oberseite der Platte mit einem Taschentuch zu entfernen, während die Platte auf dem Kopf stehend zu halten.</li>
	<li>Bereiten Sie Antikörper Cocktails für Makrophagen und DC Teilmengen (FACS-Panel 1) und T - und B-Zell-Subsets (FACS-Panel 2) wie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben. Die Bände, die in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben werden ausgewählt nach der Optimierung der Antikörper-Konzentrationen und sind ausreichend für eine Mehrwertsteuer oder sAT Probe. Hinweis: Im Bedienfeld "FACS" 1, verwenden die Marker CD303 und CD141 um zu bestätigen, dass CD11C+ CD11Bniedrigen Zellen sind DCs. Es wird jedoch empfohlen, diese Marker aus dem Panel auf einen lebenden/Toten Färbung auszuschließen. Beide FACS-Panel 1 und 2 sind kombinierbar mit der LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Fleck Kit Lebensfähigkeit Färbung wenn ausgenommen CD303 in Panel 1 als PE-Kanal unbenutzt sein wird. Durchführen Sie Lebensfähigkeit Färbung nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Das Pellet in 29,5 µL Antikörper cocktail für FACS Panel 1 und 23 µL Antikörper cocktail für FACS-Panel 2 aufzuwirbeln. Inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln auf dem Eis.</li>
	<li>Jedes gut 150 µL FACS Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet um einen zweiten Waschschritt durchzuführen. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 280 x g und 4 ° C. Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf den Kopf zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 150 µL 1 % Formaldehyd-Lösung in jeder der Zellen zu beheben. Übertragen Sie die Zellsuspension aus jedem Brunnen mit dem entsprechenden FACS-Rohr durch Pipettieren mit einer Pipette P200. FACS-Rohre bei 4 ° C in den dunklen bis zu 7 Tage aufbewahren. Hinweis: Direkte Messung ist auch möglich. Fügen Sie 150 µL FACS Puffer in jede Vertiefung statt 1 % Formaldehyd hinzu, übertragen Sie die Zellen durch Pipettieren mit einer P200-Pipette auf die entsprechenden FACS-Rohre und analysieren Sie die Zellen zu. Achtung: Formaldehyd ist sehr giftig. Bereiten Sie Formaldehyd-Lösungen während der Arbeit in einer Dampfhaube nicht einatmen und tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille zum Schutz vor.</li>
</ol>(4) Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Vor der ersten Messung mithilfe eines ungefärbten Negativkontrolle forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) festlegen. Passen Sie die Spannungen der Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers, sodass alle Populationen von Interesse im FSC und SSC Diagramm sichtbar sind und eine zwischen Schutt und lebenden Zellen Unterscheidung.</li>
	<li>Durchführen Sie Multi-Color Compensation Analyse mit Antikörper erfassen Perlen nach Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrollen durch Herstellung der Antikörper-Mischung aber schließen Sie einen Antikörper aus dem Mix aus. Dies gilt für jeden Antikörper, Schaffung von 8 Antikörper-Mischungen für FACS Panel 1 und 6 Antikörper-Mischungen für FACS-Panel 2. Diese FMO Antikörper Mischungen dienen, SVF, wie zuvor beschrieben in diesem Protokoll zu beflecken.</li>
	<li>Messen Sie alle FMO Steuerelemente und der gating-Strategie basierend auf FMO-Steuerelemente. Verwenden Sie die FMO-Steuerelemente möglich Auto-Fluoreszenz der Zellen zu erkennen. Hinweis: Entfernen Sie einen Antikörper aus dem Mix, Fluoreszenz-Ebene erkannt in diesem Kanal ist ein Hintergrund/Autofluorescent Signal. Daher, durch den Vergleich der verschiedenen FMO Kontrollergebnisse FACS, Tore auf bestimmte Bevölkerungsgruppen, um sicherzustellen, dass die Gatings auf positive Zellen basieren und nicht auf Auto-Fluoreszenz basiert gezogen werden können.</li>
	<li>Wirbel der FACS-Rohre bei 800 u/min vor der Einlagerung in das Durchflusszytometer und die Messung starten. Hinweis: Mindestens 50.000 Veranstaltungen im live Tor wird empfohlen, um sicherzustellen, dass genügend Zellen von jeder Subpopulation gemessen werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation.">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li><li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells.">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li><li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li><li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males.">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+human+adipose+tissue:+link+with+morbid+obesity,+inflammatory+status,+and+diabetes.">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li><li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fats,+inflammation+and+insulin+resistance:+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue.">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li><li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages:+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states.">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li><li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+CD11c+CD206++adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity.">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li><li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c++macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue.">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665 (2017).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages:+a+lesson+learned+from+flow+cytometry.">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Diese Methoden beschreiben, wie die SVF von der Mehrwertsteuer zu isolieren und saß und die relativen Mengen von Immunzellen in diesen Geweben zu quantifizieren. Darüber hinaus geben die Methoden wie die Expression von Markern auf bestimmte Zelltypen zu bestimmen.
Durchflusszytometrie von Immunzellen Gewebe ist eine leistungsfähige Technik für Phänotyp der immunologischen Zustand der Gewebe. Die Quantifizierung der Gewebe Immunzellen kann viele Anwendungen haben. Wie in den Ergebnissen beschrieben, ist es möglich, das Vorhandensein von bestimmten Immunzellen zwischen Gruppen von Patienten (z.B.mageres vs. fettleibig) zu vergleichen. Darüber hinaus können indem auch die Durchflusszytometrie auf Blut von den gleichen Patienten, Assoziationen zwischen zirkulierenden Zellen und Gewebe untersucht werden. Mit dieser Anwendung konnten wir feststellen, dass eine bestimmte Teilmenge der zirkulierenden Monozyten mit Pro-inflammatorischen CD11C verbunden ist+ Fettgewebe Makrophagen16.
Anpassungen des beschriebenen Protokolls werden ihre Anwendungen erweitern, wie zahlreiche verfügbare fluoreszierende Antikörper Durchflusszytometrie sehr vielseitig machen. Mit verschiedenen Antikörpern lassen sich fast alle Zelltypen unterscheiden und der Ausdruck der vielen Marker detektiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Marker intrazellulär zu beflecken, durch permeabilizing der Zellmembran intrazelluläre Bindung von fluoreszierenden Antikörpern zu ermöglichen. Diese Eigenschaften erlauben Unterscheidung der unterschiedlichsten Makrophagen Bevölkerungen über die übermäßig vereinfachten M1 und M2-Makrophagen-Subtypen. Neben der Messung der Oberfläche Marker Ausdruck können Proteine (z.B. Zytokine) intrazellulär mit Informationen über Makrophagen Funktionalität befleckt werden. Darüber hinaus werden Proliferationsmarker wie Ki67 zur Verbreitung Preise zu quantifizieren. Wie beschrieben, basierte Unterscheidung zwischen Makrophagen und DCs auf MFI Ebenen der DC-Marker. Ein allgemeine Makrophagen Marker, wie CD68 kann die Makrophagen-Panel (FACS-Panel 1) integriert werden. CD68 muss jedoch intrazellulär erfordern Permeabilisierung der Zellmembran befleckt werden, das ist nicht besser und das Protokoll erweitern würde. Weitere Makrophagen-Marker sind Teilmenge Markierungen wie CD163 und CD206 oder CD11c, letztere in der hier vorgestellten Makrophagen-Panel integriert.
In unseren FACS-Panels, ein Marker, lebende und tote Zellen zu unterscheiden wurde nicht aufgenommen, was wäre vorzuziehen, weil es einen genauere Ausschluss von abgestorbenen Zellen als die Verwendung von FSC und SSC ermöglicht. Häufig sind die DNA Färbung, Lebensfähigkeit Farbstoffe Propidium Jodid (PI) oder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) sowie freie Amin reagiert Farbstoffe wie die LIVE/DEAD fixierbar tote Zelle färben Kit, die in verschiedenen Dye Farben erhältlich. Jedoch kann nicht PI und DAPI verwendet werden, wenn die Zellen zu fixieren. Wie im Protokoll beschrieben, die LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Lebensfähigkeit Färbung in beide Platten integrierbar ohne Auswirkungen auf die gesamte FACS Anspritzung Strategie.
Darüber hinaus werden die Daten ausgedrückt als Prozentsatz der lebenden Zellen, was bedeutet, dass alle Daten sind relativ. Nur durch Eingabe einer genauen, wäre bekannt, Anzahl der Zellen in das Durchflusszytometer es möglich die genauen Zahlen der einzelnen Zelle bestimmen. Eine ungefähre Anzahl von Zellen konnte nach dem zählen der Zellen in der SVF-Fraktion mithilfe einer Zählkammer berechnet werden. Diese Zahl müsste für die Höhe der Biopsie Gewebe verwendet, um die SVF isolieren angepasst werden, aber dies hat Einschränkungen beim lehnen zu fettleibig zu vergleichen. Eine ähnliche Masse von adipösen AT besteht aus weniger Fettzellen, wie sie mit Lipiden gefüllt sind und stark erweitert haben. Dies führe zu einer Unterschätzung der Immunzelle Zahl wenn als Anzahl der Immunzellen pro Gramm bei oder Adipocyte dargestellt.
In Humanstudien erfolgt Einbeziehung von Patienten in der Regel über einen längeren Zeitraum hinweg machen Standardisierung von experimentellen Verfahren von großer Bedeutung. Für den Vergleich von Flow Cytometry Daten zwischen Patienten gibt es mehrere Möglichkeiten. Wie in diesem Protokoll beschrieben, können Zellen vor der Messung erlaubt die Analyse von mehreren Proben am gleichen Tag behoben werden. Dies kann auch erreicht werden, durch das Einfrieren der SVF, bevor sie beflecken, wodurch das Färbeverfahren zwischen allen Proben gleich sein, aber die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden könnte. Zu guter Letzt auch in dieser Studie beschäftigt, fluoreszierende Perlen Vergütungsstufen zu installieren sind und Cytometer Tracking Perlen wurden zweimal wöchentlich verwendet, um tägliche Messungen der Cytometer standardisieren. Diese letzte Option ist die effizienteste beim Ausmessen von Proben aus einer Studie, die über einen langen Zeitraum hinweg.
Ein limitierender Faktor für Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen die Verwendung der Fluoreszenz. Die Anzahl der Fluoreszenzmarkierungen, die gleichzeitig erkannt werden können ist begrenzt durch Überlappung in Emissionsspektren. Jedoch kann mit smart FACS-Panel-Entwicklung und den Einsatz von mehrere Antikörper Cocktails pro MwSt oder sAT Probe, dieses Problem überwinden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Ein wichtiger Aspekt der FACS-Panel-Entwicklung ist FMO Kontrollen. Mithilfe des Fensters mit einer Ausnahme alle Antikörper können potenzielle Autofluoreszenz Ebenen beim Vergleich der FMO mit Vollelement geschätzt werden. Dies ermöglicht genaue Anspritzung von Populationen und diese Verfahren durchgeführt werden, wenn Sie ein neues FACS-Panel einrichten. Darüber hinaus können neue Generationen von FACS-Geräte bis zu 50 Parameter ermöglicht simultane Detektion von vielen Merkmalen pro Zelle erkennen. Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Fluoreszenz-Aspekt ist die Autofluoreszenz der Zellen, insbesondere Makrophagen. Nach Anregung der Zellen mit dem FACS-Laser (vor allem mit 488 nm Wellenlänge Anregung), diese Zellen emittieren ein Fluoreszenzsignal (hauptsächlich < 640 nm), dass können Überschneidungen mit den Emissions-Spektren des Antikörpers Etiketten17,18. Um dies zu berücksichtigen, sollte ungefärbte Zellen gemessen werden, um festzustellen, die Autofluoreszenz in jedem Kanal. Mit diesem wissen sollten Fluorochromes ausgewählt werden, in denen eine Signalstärke angezeigt, die das Autofluorescent Signal. Diese Autofluorescent Hintergrundsignal sollte bei der Festlegung die gating-Strategie der Bevölkerung berücksichtigt werden. Durch Anwendung dieses Protokolls und intelligente FACS-Panel-Design ist es deshalb möglich, in Tiefe Phänotyp Makrophagen Subtypen. Neue eindeutige AT Makrophagen und deren Funktion charakterisiert werden können.

Adipositas ist gekennzeichnet mit Low-Grade AT Entzündung1 und Infiltration von Pro-inflammatorischen Immunzellen im viszeralen und subkutanen an (MwSt., saß). Ansammlung von Pro-inflammatorischen Immunzellen in den Bottich führt zu einer Insulinresistenz ist ein primärer Risikofaktor für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes-2. Immunzellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems befinden sich in der übergewichtige, wie Makrophagen, Mastzellen, Neutrophile, CD4+ und CD8+ T-Zellen und B-Zellen3,4,5,6 ,7. Diese Immunzellen zusammen mit Endothelzellen, stromale Zellen Adipocyte Stammväter, Fibroblasten und Perizyten, bilden die SVF-8 und sind die wichtigste Quelle von Pro-inflammatorischen Substanzen im AT9.
Der Entzündungsstatus AT wird häufig durch Techniken einschließlich Western-Blot10, qPCR11und Immunohistochemistry11untersucht. Jedoch ist bei der Verwendung dieser Techniken, die gesamte AT, Adipozyten und SVF verwendet. Dies macht es schwierig zu bestimmen, die Menge und Teilmengen von Immunzellen in der AT vorhanden. Immunzellen haben verschiedene Zelle Marker zu definieren und zu kategorisieren, wie z. B. Makrophagen. Makrophagen zeigen erhebliche Heterogenität in Funktion und Zelle Oberfläche Marker Ausdruck12. Daher sind sie oft in zwei Populationen von Makrophagen kategorisiert: M1 und M2. M2-Makrophagen nennt man in der Regel Alternativ aktivierten Makrophagen12,13 und befinden sich in der schlanken, metabolisch normale Menschen14. Tritt jedoch bei Übergewicht, ein phänotypische Schalter von M2-Makrophagen, M1 Makrophagen. Diese aktiviert klassisch M1 Makrophagen express CD11C12 und reichern sich um tote Adipozyten, Krone-artige Strukturen13zu bilden. Es hat sich gezeigt, dass CD11C+ Makrophagen in der Insulinwirkung beeinträchtigen und Insulinresistenz bei adipösen Menschen15zugeordnet sind. Immunohistochemistry ist zur Erkennung von M1 und M2-Makrophagen im AT eine Option. Diese Technik bietet Informationen über den Standort von den Makrophagen im Gewebe. Allerdings schränkt es die Anzahl der Markierungen, die in einer Färbung verwendet werden können. Darüber hinaus ist es auch schwierig zu quantifizieren. Um die verschiedenen Immunzellen Teilmengen in der Mehrwertsteuer und sAT Einlagen zu untersuchen, haben wir daher einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mehrere Markierungen pro Zelle mit einem Flow-Zytometrie-Analyse zu Zelle Teilmengen zu definieren und zählen die Anzahl der einzelnen Untergruppen in den AT-Ablagerungen vorhanden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Rotanta 460R</td>
			<td>5660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)-Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>31330-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7657-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06688.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;M syringe Filcons</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M filter</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block / human IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04003.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c-APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>337218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-H7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>641400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD303-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>354204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD141-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS-Canto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 v-shape well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS PH 7.4</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rat Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L23102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA&#160;MS 3 basic shaker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z645028-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

Infiltration von Immunzellen in das subkutane und viszeralen Fettgewebe (AT) Ablagerungen führt zu einer minderwertigen Entzündung einen Beitrag zur Entwicklung der Adipositas-assoziierten Komplikationen wie Typ-2-Diabetes. Um quantitativ und qualitativ die Immunzelle Teilmengen in menschlichen auf Einlagen zu untersuchen, haben wir einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF), mit der Immunzellen ist von subkutanem und viszeralem bei Biopsien von Kollagenase Verdauung isoliert. Fettzellen werden nach der Zentrifugierung entfernt. Die SVF-Zellen sind für mehrere Membrane-springen-Marker zur Unterscheidung zwischen Immunzellen Teilmengen ausgewählt und mittels Durchflusszytometrie analysiert gefärbt. Als Ergebnis dieses Ansatzes pro- und antiinflammatorische Makrophagen Teilmengen, dendritische Zellen (DCs), B-Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen und NK-Zellen erkannt und quantifiziert werden können. Diese Methode gibt detaillierte Informationen über Immunzellen im AT und die Höhe der jeweils spezifischen Teilmenge. Da gibt es zahlreiche fluoreszierende Antikörper zur Verfügung, kann unser Flow Cytometry Ansatz zur Messung der verschiedenen anderen zellulären und intrazellulären Marker von Interesse eingestellt werden.

Die SVF isoliert von der Mehrwertsteuer und saß wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Flow Cytometry Messungen erzeugen Grundstücke zeigen unterschiedliche Zellpopulationen basierend auf zellulärer Marker (Abbildung 1A und 1 b). Zunächst durch Auftragen der Stürmer streuen Breite (FSC-W) und forward Scatter Bereich (FSC-A), Zelle, die Aggregate von weiteren Analyse ausgeschlossen werden können, durch Anspritzung Einzelzellen als niedrige FSC-W. Nächste, live Zellen ausgewählt sind, und Zelltrümmer ist ausgeschlossen durch Anspritzung der Zellen die richtige Größe und Komplexität mit FSC-A und der Seite streuen Bereich (SSC-A), beziehungsweise. Abgestorbenen Zellen sind klein und daher als eine verschiedene Bevölkerung sichtbar mit einem kleinen FSC-A. Nächste, immune Zellen wurden durch Verwendung von Pan-Leukozyten-Marker CD45 (Panel 1 und 2, Abb. 1A) ausgewählt. Um Makrophagen zu analysieren, andere Immunzellen wie die T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD19), Neutrophile (CD66b+ CD11b+), und NK-Zellen (CD56) wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen, über verschiedene Antikörper, die gezielt diese Zellen, sondern mit der gleichen Fluorochrom. Weitere Unterteilung der verbleibenden Zellen basierte auf CD11b, CD11c Ausdruck. Dies führte in den folgenden Populationen: CD11b+ CD11c+ Makrophagen, CD11b+ CD11c– Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs (FACS Panel 1, Abbildung 1 b). Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) erlaubt die Quantifizierung des Ausdrucks von CD303 (plasmazytoide DC Markierung) und CD141 (DC-Marker), auf CD11b+ CD11c+ Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs. Ausdruck dieser beiden Marker waren höher bei CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen bestätigt, dass CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen wurden DCs (Abbildung 1).
Das CD45+ Zellen (Abbildung 1A) wurden in T-Zellen und B-Zellen unterteilt mit CD3 und CD19, beziehungsweise. T-Zellen wurden unterteilt in T-Helferzellen (CD4+) und zytotoxischen T-Zellen (CD8+). Zu guter Letzt CD3–CD19–-Zellen, NK-Zellen mit dem Marker CD56 zu quantifizieren gezeichnet wurden (FACS-Panel 2, Abbildung 1). Die Anzahl der Zellen in jedem Tor wird quantifiziert und kann zur Berechnung des Anteils dieser Zellentyp aller lebenden Zellen (Tabelle 3).
Der Anteil der lebenden Zellen kann berechnet werden, für jedes Fach ermöglicht die Berechnung der durchschnittlich alle Themen in einer Gruppe von zum Beispiel mageres oder übergewichtige Männer zeigt die Fülle an eine bestimmte Immunzellen, d. h., der Pro-inflammatorischen CD11b+ CD11c+ Makrophagen in viszeralen AT (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Abbildung 1: FACS Anspritzung Strategie des viszeralen Fettgewebes. (A) FACS Handlung aller Ereignisse (schwarz) mit forward Scatter breite Intensität (FSC-W) und forward Scatter Bereich Intensität (FSC-A) mit einem Tor wählen Sie nur einzelne Zellen (rot), gefolgt von einem FACS-Grundstück basierend auf FSC-A und seitliche Streuung Bereich Intensität (SSC-A) enthält eine Auswahl von lebenden Zellen (hellgrün) Tor. Als nächstes Grundstück mit SSC-A und CD45 Fluoreszenzintensität enthält eine Auswahl aller CD45 Tor+ (immun-) Zellen (blau). (B) FACS Grundstück CD19, CD3, CD66b und CD56 Fluoreszenzintensität versus CD11b Fluoreszenzintensität und ein Tor auswählen alle Zellen, die CD19, CD3, CD66b und CD56 negativ sind (braun) für weitere Unterteilung in Populationen. Weitere Unterteilung in die nächste Handlung basierend auf CD11b und CD11c Fluoreszenz-Intensität. Tore werden angezeigt, enthält CD11b+ CD11c+ Makrophagen (dunkelgrün), CD11b+ CD11c– Makrophagen (lila) und CD11bniedrig /- CD11c+ dendritische Zellen (blau). (C) Menge von CD11b+, CD11c+, oder CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen (Y-Achse) ihre Ebenen der Fluoreszenzintensität (X-Achse) für CD303 und CD141 und die entsprechenden Quantifizierung des Mittelwerts anzeigen Fluoreszenzintensität (MFI). (D) FACS Plot zeigt die bisherigen CD45+ Bevölkerung (blau) basierend auf CD3 und CD19 Fluoreszenzintensität mit Toren, die Auswahl von T-Zellen (Magenta), B-Zellen (dunkelgrün) und nicht-Autofluorescent Zellen (grün) negativ für beide CD3 und CD19. Die folgende Handlung basiert auf CD4 und CD8 Fluoreszenz mit Toren Auswahl CD4+ (hellgrün) und CD8+ (Magenta) T-Zellen. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Diese Zahl wurde von Wouters Et Al. modifiziert 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Abbildung 2: Fettleibige MwSt enthält mehr Pro-inflammatorischen Makrophagen. Die Höhe der CD11b+ CD11c+ Makrophagen als Prozentsatz aller lebenden Zellen in Bottich von mageren und fettleibigen Menschen präsentiert. Alle Daten sind Mittel ± SEM; n = 20 für Lean und n = 31 für übergewichtige. p ≤ 0,01 vs. Lean. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloische Integrin-marker</td>
			<td>Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellengering und natürliche Killerzellen</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>Mitglied der carcinoembryonales Antigen (CEA)-wie Glykoprotein-Familie</td>
			<td>Granulozyten</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>Typ II transmembranen glycoprotein</td>
			<td>plasmazytoide dendritische Zellen</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>Monozyten/Makrophagenniedrig, Subpopulation von dendritischen Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>Typ I transmembranen Glycoprotein; Integrin αx</td>
			<td>Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen, Granulozyten, natürliche Killerzellen, Teilmenge von B und T-Zellen</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Antikörper für cocktail FACS pAnel 1, Teilmengen von Makrophagen und dendritischen Zellen Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>IG-Superfamilie, Typ I transmembranen Glycoprotein</td>
			<td>T-Helfer-Zell, Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Typ II natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-Untereinheit eines Disulfid-linked bimolekulare komplexes</td>
			<td>zytotoxischen T-Zellen, Thymozyten, Teilmenge der natürlichen Killerzellen</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Antikörper für cocktail FACS Panel 2, T und B-Zell-Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrophagen-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td># Zellen</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dump–
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C– CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bniedrig /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-Zellen, B-Zellen, NK-Zell-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK-Zellen</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0,54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Immunzelle Fülle verschiedener Zelltypen der Mehrwertsteuer. Anzahl der Zellen in jedem Tor und der Prozentsatz der verschiedenen Zelltypen bezogen auf die Gesamtmenge von lebenden Zellen.

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K Aufrufe.  MUMC. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.

Serie: Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in humans. Detecting BAT is typically confirmed by the uptake of the injected radioactive tracer 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) into adipose tissue depots, as measured by positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) scans after exposing the subject to cold stimulus. Fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI) has the ability to distinguish BAT without the use of a radioactive tracer. To date, MRI of BAT in adult humans has not been co-registered with cold-activated PET-CT. Therefore, this protocol uses 18F-FDG PET-CT scans to automatically generate a BAT mask, which is then applied to co-registered MRI scans of the same subject. This approach enables measurement of quantitative MRI properties of BAT without manual segmentation. BAT masks are created from two PET-CT scans: after exposure for 2 hr to either thermoneutral (TN) (24 &#176;C) or cold-activated (CA) (17 &#176;C) conditions. The TN and CA PET-CT scans are registered, and the PET standardized uptake and CT Hounsfield values are used to create a mask containing only BAT. CA and TN MRI scans are also acquired on the same subject and registered to the PET-CT scans in order to establish quantitative MRI properties within the automatically defined BAT mask. An advantage of this approach is that the segmentation is completely automated and is based on widely accepted methods for identification of activated BAT (PET-CT). The quantitative MRI properties of BAT established using this protocol can serve as the basis for an MRI-only BAT examination that avoids the radiation associated with PET-CT.

The method presented here uses 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) and fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI), each scanned following 2 hr exposure to thermoneutral (24 &#176;C) and cold conditions (17 &#176;C) in order to map brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects.

Menschen braunes Fettgewebe Depots automatisch durch Positronenemissionstomographie / Computertomographie Segmentierte und Registrierte Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Ganzen Körper und regionale Quantifizierung der aktiven Menschen braune Fettgewebe mit 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...