Zu Beginn legen Sie Kollagen, Natriumhydroxid, steriles Reinstwasser, 10-mal PBS, ein Mikrozentrifugenröhrchen, methacrylierte Hyaluronsäure und den Photoinitiator auf Eis. Legen Sie dann die Gewebekultureinsätze in die Platte und beschriften Sie diese. Um drei Milligramm pro Milliliter Kollagenlösung herzustellen, kombinieren Sie hochkonzentriertes Kollagen, ein normales Natriumhydroxid, ultrareines Wasser und das 10-fache PBS.
Geben Sie Komponenten in das Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Pipettenspitze beim Mischen untergetaucht, um Blasenbildung zu vermeiden. Danach zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann vorsichtig überschüssiges Medium von der Oberseite jeder Zellzustandslösung, wobei das für den Zustand erforderliche Medienvolumen übrig bleibt.
Lege diese Lösungen auf Eis. Fügen Sie das berechnete Volumen der Kollagenlösung zu jeder Zellzustandslösung hinzu. Als nächstes fügen Sie das berechnete Volumen von 1% methacrylierter Hyaluronsäure hinzu, gefolgt von 17 Milligramm pro Milliliter LAP in jeder Zellzustandslösung.
Mischen Sie jedes Konditionsröhrchen nacheinander, während Sie die Pipettenspitze untergetaucht lassen, um Blasenbildung zu vermeiden, und geben Sie 100 bis 150 Mikroliter zu jedem Gewebekultureinsatz. Schalten Sie nun die 385 Nanometer UV-Lampe bei konstantem Strom ein. Um jedes Gel zu vernetzen, setzen Sie es jeweils 45 Sekunden lang ultraviolettem Licht aus.
Stellen Sie die Platte dann 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf, um das Kollagen zu vernetzen. Unter Verwendung eines astralen Basalmediums mit 0,5 % und zwei Volumen-für-Volumen- und 1 Vol.-% B27 ohne Vitamin A tragen Sie den Flüssigkeitsdruckkopf auf Gele auf. Geben Sie Medien auf die Well-Platte und die Gewebekultureinsätze, um einen Netto-Null-Fluss zu erzielen.
Stellen Sie die Platte mindestens 18 Stunden oder bis zu fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid auf.
