Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant # 1R01CA120825-01A1, die Collaborative Biomedical Research (CBR) Program an der University of Massachusetts Amherst und der Isenberg Stipendium für Bhushan J. Toley unterstützt. Wir danken den wertvollen Beitrag von James Schafer, der Videofilmer, Erzähler und Herausgeber dieses Videos.

Ein. Vorrichtung Fabrication Replikation von mikrofluidischen Merkmale in Elastomermaterialien wurde für das Verfahren von Duffy et al beschrieben ist. 1 <ol><li> Mix Elastomer (Polydimethylsiloxan; PDMS) und Härter aus der Silikon-Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) in einem 9:1 Gewichtsverhältnis und übergießen Sie den Master mit einem 4 mm dicken Schicht bilden. Entgasen zur Entfernung von Luftblasen und aushärten der Mischung bei 60 ° C für 5 Stunden. Peel gehärteten PDMS aus der Form, um einen Stempel Strömungsrichtung Merkmale auf dem Elastomer zu erhalten. </li><li> Stanzlöcher für Ein-und Auslässe mit einem 1,5 mm Biopsiestanze (Miltex, York, PA), die an einer Bohrmaschine. Ziehen Sie alle Fremdkörper. </li><li> Thema Die Funktionen Seite des Stempels und einer sauberen Glasobjektträger einem Sauerstoffplasma für 8 Minuten in einem Sauerstoffplasma Radierer. Bringen der behandelten Flächen in Kontakt sofort, um eine Bindung zwischen ihnen auszubilden. Pflegen Sie die Montage bei 60 ° C auf einer Folie wärmer für mindestens 5 Stundens zur Stärkung der Bindung. </li><li> Verbinden 0,032 &quot;ID PTFE-Schlauch (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) zu den Einlässen und Auslässen über eine Schnittstelle des männlichen Luer-Lock-Anschlüsse angebracht Widerhaken weiblichen Luer-Lock Verbinder (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Richten Sie die Fließmontage mit Absperrventilen und eine Y-Stecker (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Abbildung 1). Montieren Sie das Gerät mit dem Mikroskop. Bringen Spritzen Schlauch mit 20G 1,5 &quot;Nadeln (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Bildung Uniform Spheroids Sphäroide wurden von der hängenden Tropfen-Methode 2,3 gebildet. <ol><li> Trypsinieren Zellen unter einer sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Zentrifuge trypsinierten Zellen bei 2000 rpm für 5 Minuten und resuspendieren in 6 ml frisches Medium. Verdünnen der Stammlösung zu einer gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie den Deckel einer 48-Well-Platte und legen Sie sie kopfüber in die sterilized Kapuze. Circular entsprechenden Bereiche in jede Vertiefung sind auf dem Cover ersichtlich. Füllen Sie jede Vertiefung der Platte mit 1 ml sterilem Wasser Feuchtigkeit halten. Setzen Sie einen 20 ul Tropfen der verdünnten Zell-Lösung in jedem kreisförmigen Bereich mit einer Mikropipette. Sorgfältig invertieren Sie die Abdeckung und legen Sie es über den Well-Platte, so dass die Tropfen nicht berühren die Kanten der Brunnen. </li><li> Inkubieren der Mikrotiterplatte bei 37 ° C für eine bestimmte Anzahl von Tagen (Tabelle 1). Ein Sphäroid wird in jedem hängenden Tropfen bilden. </li></ol> 3. Einführung der Sphäroide in Device Siehe Abbildung 1 und Tabelle 2 für diesen Abschnitt Abbildung. <ol><li> Sterilisieren der Vorrichtung durch Spülen mit 70% Ethanol durch die Strömungseinlaß eingeführt. Anschließend bündig mit PBS gefolgt von HEPES gepufferte Zellkulturmedium. Lassen Sie das Medium Spritze S F an den Schläuchen. </li><li> Zeichnen 2-3 Sphäroide in die Spritze S P, tippen Spritze, um Luftblasen zu entfernen, undBefestigen der Verpackung Einlaß der Vorrichtung. </li><li> Offene Einlaßventil V Pin und enge V Fin. Geöffnete Auslassventil V Pout und enge V Fout. Halten Sie die Verpackung Spritze senkrecht mit der Nadel nach unten; zusehen, wie Sphäroide auf den Boden der Spritze niederlassen in den Luer-Lock-Anschluss der Nadel. Drücken Sie den Kolben auf der Verpackung Spritze und Uhr Sphäroide geben Sie den Schlauch und fließen in das Gerät. Weil nur die Packung Auslaßventil offen ist, wird ein Sphäroid die Kammer eintreten der Vorrichtung und durch Stützen auf der Rückseite (Fig. 2) erhalten. </li><li> Einlass schließen V Pin und Auslassventil V Pout. Montieren der Spritze S F auf einer Spritzenpumpe. Öffnen Sie das Ventil V Fin und Ventil V Fout. Fördermedium in das Gerät 3 ul / min. </li></ol> 4. Einleitung der Apoptose Erkennen Agent (CaspGLOW) Nach dem Packen Kammern mit Sphäroide erlauben Äquilibrierung für up bis 24 Stunden, um Nährstoff Gradienten und Mikroumgebungen herzustellen, vor dem Einführen Apoptose Nachweisen oder Therapeutika. Da die Gewebe in den Kammern in Kontakt mit undurchdringlichen Mauern von oben und unten sind, gibt es keine Nährstoff Gradienten entlang der Dicke (0,15 mm) des Gewebes. Nach 24 Stunden Inkubation werden alle Zellschichten entlang der Dicke des Gewebes entspricht mithin und die einzige Heterogenität ist in einer Richtung weg von dem Strömungskanal. <ol><li> Abgeschaltet V Fin, stoppen Sie die Spritzenpumpe Spritze abnehmen S F von der Pumpe und ersetzen sie durch eine Spritze mit Medium mit 0,25 ul / ml CaspGLOW Red Aktive Caspase-3 Marker (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manuell bündig 0,7 ml dieser Lösung durch die Vorrichtung, um eine Verschiebung der älteren Medium zu gewährleisten. Montieren Sie die Spritze an der Pumpe, starten Flow und offenen V Fin. Über einen Zeitraum von 5-8 Stunden, Erfassen der Apoptose Agenten diffundiert in tEr Gewebe und fluoresziert heller apoptotischen Regionen. Apoptosis Sprühmittel bei dieser Konzentration wird in allen weiteren Workflow-Lösungen in das Gerät erhalten. </li></ol> Hinweis: <ol class="lroman"><li> Tissue Heterogenität kann durch den Erwerb lineare Intensitätsprofile der Fluoreszenz, wie in Abschnitt 6 beschrieben bestätigt werden. Die Profile sollten räumlichen Gradienten in der Apoptose zeigen, bestätigt, dass das Gewebe heterogen in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen ist. </li><li> CaspGLOW Grün Aktiv Caspase-3 Marker (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision) kann auch verwendet werden, um die Apoptose zu detektieren. Dieser Marker enthält das grüne Fluorophor Fluorescein anstelle des roten Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin. </li></ol> 5. Einführung des therapeutischen Wirkstoffs <ol><li> Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 4,1-4,2 bis 10 uM Doxorubicinhydrochlorid (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) einzuführen, die Apoptose Sprühmittel. </li><li> Weiterhin Strömung des therapeUTIC Wirkstofflösung für eine feste Zeitspanne. Absperrventil V Fin und schalten Sie die Spritzenpumpe. Ersetzen der Behandlung Spritze mit einer Spritze, die frisches Medium Apoptose Nachweismittel. Erlauben Strömung von frischem Medium für 24 Stunden unter -36 kontinuierliches Überwachen des Gewebes unter dem Mikroskop. </li></ol> 6. Zeitraffer-Mikroskopie und Estimation of Drug Diffusivität Koeffizienten Zum Erhalten saubersten Fluoreszenzdaten, alle Bilder zu erwerben durch Fokussieren des Mikroskops auf die unteren Schichten von Geweben. Da es keine Nährstoff-Gradienten in vertikaler Richtung (siehe Abschnitt 4), sind die unteren Schichten von Zellen gute Vertreter aller anderen Schichten über. <ol><li> Die gesamte Übernahme-Prozess automatisiert wurde mithilfe einer angepassten Skript in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Erwerben Durchlicht und Fluoreszenz-Aufnahmen des verpackten Sphäroid bei 10facher Vergrößerung alle 30 Minuten (Abb. 3A). AcquirE ein Bild der Hintergrundfluoreszenz vor der Einführung Dox. Um nach der Größe der Kammer (x 1000 um 300 um) unterzubringen, zu erwerben zwei angrenzenden Bildern und überlappend, gemeinsam 4. </li><li> Für mathematische Schätzung Medikament Diffusivität Koeffizienten, ist der erste Schritt, um gemittelte linearen Intensitätsprofile Dox Fluoreszenz unter Verwendung ImageJ erzeugen. Wähle einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), das die Gewebe in der Kammer. Verwenden der Plot Befehl Profil, ein Profil der mittleren Intensitäten als eine Funktion des Abstandes von dem Strömungskanal zu erzeugen. Wiederholen Sie dies für bis zu 3 verschiedenen Zeitpunkten. </li><li> Besorgen Sie sich eine Hintergrundfluoreszenz Bild vor Einführung Dox zur Autofluoreszenz aus dem Gewebe zu messen. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität aus den erhaltenen Intensitätsprofile und normalisieren jedes Profil durch die entsprechende maximale Intensität zu erhalten <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (Abb. 3B). </li><li> Der nächste Schritt ist, den effektiven Diffusionskoeffizienten D der Dox innerhalb Tumorgewebe auszuwerten. Dox Diffusion kann durch die folgende Gleichung 5 dargestellt werden <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Gleichung 1"/> wobei die komplementäre erfc Fehlerfunktion ist, x Abstand in das Gewebe aus dem Kanal, und t die Zeit nach dem Einbringen Dox (s. Abbildung. 3). Verwenden Sie die folgenden iterativen Schema zu jedem Zeitpunkt in Betracht gezogen: <ul><li> Ratet mal, einen Wert für D </li><li> Berechnen rechten Seite der Gleichung an jedem Ort x </li><li> Berechnen der Summe der quadrierten Fehler (Rest-) zwischen den zwei Seiten </li><li> Ändern D den Rest-Minimierung </li></ul></li><li> Durchschnittlichen die optimalen Werte von D zu jedem Zeitpunkt erhalten, um die durchschnittliche effektive Diffusionskoeffizient Dox im Gewebe abzuschätzen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Mikrofluidikeinheiten 1mm x 0.3mm x 0.15mm optisch zugänglichen Kultur Kammern für das Wachstum von dreidimensionalen Tumorgewebe. Vielzelligen Tumorsphäroide wurden in diesen Kammern geflogen und wurden durch zwei Filter Beiträge auf der Rückseite erhalten. Der hängende Tropfen Verfahren erlaubt schnelle Bildung von Sphäroiden konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien. Sphäroide wurden erfolgreich auf dem Gerät gewachsen für bis zu 3 Tage. Das Wachstum in den Kammern wurde mit einer reproduzierbaren Änderung Mikroumgebungen in Sphäroide verbunden. Apoptose in Zellen aufgetreten weniger in der Nähe des Strömungskanals und höheren tiefer in das Gewebe. Die Vorrichtung wurde verwendet, um den Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin in Tumorgewebe zu schätzen. Der erhaltene Wert von 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 stimmt der Wert von 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 zuvor berichtet 6 in menschlichen Brustkrebszellen. <table border="1"><tbody><tr><td> Cell Line </td><td> Erforderliche Zellkonzentration </td><td> Inkubationszeit </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 Zellen / ul </td><td> 2-3 Tage </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 Zellen / ul </td><td> 3-4 Tage </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 Zellen / ul </td><td> 5-6 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Parameter für hängenden Tropfen Spheroids <table border="1"><tbody><tr><td> Teil </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flow Spritze </td></tr><tr><td> S P </td><td> Verpackung Spritze </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flow Einlassventil </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Verpackung Einlassventil </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Flow Auslassventil </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Verpackung Auslassventil </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spritzen und Ventile in Flow-Setup <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung des Flow Setup V Fin und V Fout:. Flow-Einlass-und Auslassventile, V Pin und V Pout: Verpackung Einlass-und Auslassventile, S F und S P: Flow und Verpackung Spritzen. Die Verpackung Spritze und Verpacken und Auslaßventile werden verwendet, wenn ein Sphäroid in die Kammer geflogen wird. Die Strömung Spritze und Strömungseinlaß und Auslaßventile werden verwendet, um Medium anschließend fließen. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schema eines Sphäroids in einer Kammer auf der Vorrichtung gefangen. Ein Sphäroid in die Kammer auf der Vorrichtung durchströmt und durch zwei Filter blockiert posts an der Rückseite der Kammer. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Doxorubicin Diffusion in Tumorgewebe auf dem Gerät. A. Zusammengeführt Durchlicht und rot fluoreszierenden Bild des Gewebes, des Standorts und der Konzentration von Doxorubicin (in rot). Maßstab stellt 250 um. B. Normalized lineare Intensität Profil von Doxorubicin Fluoreszenz.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Gefäßsystem in Tumoren ist spärlich und schlecht entwickelten 7,8. Es gibt Regionen weit (&gt; 100 um) aus den Blutgefäßen, die unzugänglich Nährstoffe und Medikamente obwohl das Gefäßsystem 9 zugeführt werden entfernt. Die resultierende heterogene Mikroumgebung trägt zur begrenzten Wirksamkeit vieler Chemotherapeutika 10. Die Mikrofluidvorrichtung hier entwickelten erschafft ein heterogenes Tumormikroumgebung durch proliferierende, ruhende und apoptotischen oder nekrotisc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namen Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Biopsiestanze </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31aa </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE-Schlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Barbed weiblichen Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Absperrventil </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-Verbinder </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;Nadeln </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluorescein </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicinhydrochlorid </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Menschliche Koloncarcinomzelllinie </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Menschliche duktales Karzinom-Zelllinie </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Menschlichen Mamma-Adenokarzinom-Zelllinie </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Wir haben eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die Lieferung und die systemische Clearance von Medikamenten zur heterogenen dreidimensionalen Tumorgewebe in vitro imitiert entwickelt. Nährstoffen durch Vaskulatur geliefert fehlschlagen, alle Teile von Tumoren zu erreichen, was zu heterogenen Mikroumgebungen bestehend aus lebensfähigen, Ruhestrom und nekrotischen Zelltypen. Viele Krebsmedikamente nicht effektiv durchdringen und behandeln alle Arten von Zellen, weil dieser Heterogenität. Monoschichten von Krebszellen nicht nachzuahmen diese Heterogenität, was es schwierig macht Krebsmedikamente mit einem geeigneten in vitro-Modell zu testen. Unsere mikrofluidischen Bauteilen wurden aus PDMS hergestellt mit weichen Lithographie. Vielzelligen Tumorsphäroide, durch den hängenden Tropfen-Verfahren gebildet wurden eingesetzt und in rechteckige Kammern auf der Vorrichtung eingespannt und gehalten mit Endlosmediums Perfusion auf einer Seite. Die rechteckige Form der Kammern auf dem Gerät erstellt lineare Gradienten im Gewebe. Fluoreszenzfarbstoffe wurden verwendet, um th zu quantifizierene Variabilität Apoptose innerhalb Gewebe. Tumore auf der Vorrichtung wurden mit dem fluoreszierenden Chemotherapeutikum Doxorubicin, Zeitraffer-Mikroskopie wurde verwendet, um ihre Diffusion in Gewebe zu überwachen, und der effektive Diffusionskoeffizient wurde geschätzt behandelt. Die hängenden Tropfen Methode erlaubt schnelle Bildung einer einheitlichen Sphäroide aus mehreren Krebszelllinien. Das Gerät aktiviert Wachstum von Sphäroiden für bis zu 3 Tage. Cells in der Nähe des strömenden Mediums waren minimal apoptotischen und die weit aus dem Kanal waren apoptotische und damit exakt imitiert Regionen in Tumoren neben Blutgefäße. Der geschätzte Wert des Doxorubicin Diffusionskoeffizient vereinbarten mit einem zuvor gemeldeten Wert in menschlichen Brustkrebszellen. Da die Penetration und Retention von Drogen in soliden Tumoren wirkt sich auf ihre Wirksamkeit, glauben wir, dass dieses Gerät ein wichtiges Instrument zum Verständnis des Verhaltens von Drogen, und die Entwicklung neuer Krebstherapeutika ist.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen nachbildet<em&gt; In vitro</em&gt;. Die Variabilität in der Apoptose in Tumorgewebe wurde quantifiziert mit Fluoreszenzfarbstoffen und die effektive Diffusionskoeffizient des Chemotherapeutikum Doxorubicin in Tumorgewebe wurde ausgewertet.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K Aufrufe.  University Of Massachusetts Amherst. Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen nachbildet In vitro. Die Variabilität in der Apoptose in Tumorgewebe wurde quantifiziert mit Fluoreszenzfarbstoffen und die effektive Diffusionskoeffizient des Chemotherapeutikum Doxorubicin in Tumorgewebe wurde ausgewertet.

Serie: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Aufbau einer mikrofluidischen Vorrichtung zur kombinatorischen Steckerherstellung

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autor im Rampenlicht: Integration von computergestützten und experimentellen Ansätzen in der Präzisionsonkologie

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Zweischichtiges mikrofluidisches Gerät für die kombinatorische Steckerproduktion

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...