Zu Beginn haben wir unsere mit der Schleife transfizierten HEK293-T-Zellen in einer Poly-D-Lysin-beschichteten 96-Well-Platte gesplittet. Als nächstes bereiten Sie drei frische Lösungen von Rhosin, Ehop-016 und ZCL278 in einer 1,7-Milliliter-Mikrofuge II vor. Geben Sie lebendes Zellsubstrat für Renilla-Luciferase, verdünnt 1 bis 2.000, bis zu einer Endkonzentration von 30 Millimolar zu jeder Lösung. Zur Herstellung von 0,55 und 50 mikromolaren ZCL278-Lösungen führen Sie serielle Verdünnungen mit den anfänglichen 50 mikromolaren ZCL278 in Nährmedien durch.
Entfernen Sie dann das Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte, die transfizierte Zellen enthält. Geben Sie 50 Mikroliter der Mischung aus Chemikalie und Substrat in jede Vertiefung. Nachdem Sie die Zellen eine Stunde, zwei oder fünf Stunden lang inkubiert haben, laden Sie die Platte auf den Lumineszenzplatten-Reader und messen Sie die Lumineszenz.
Stellen Sie sicher, dass der Plattenleser eingeschaltet ist, bevor Sie beginnen. Greifen Sie auf die Microplate Reader Software zu und klicken Sie auf Neue Sitzung, um eine neue Datei zu erstellen. Klicken Sie auf Inkubator, um die Temperatur des Plattenlesers auf 37 Grad Celsius einzustellen.
Aktivieren Sie die Temperaturoption und geben Sie 37 Grad Celsius ein. Wählen Sie unter Plattenlayout die Option unbekannt aus, klicken und ziehen Sie die Vertiefung, um die zu messenden Vertiefungen anzugeben. Gehen Sie dann zu Protokoll, klicken Sie auf Lumineszenz und behalten Sie die Standardeinstellungen bei.
Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, legen Sie die Platte mit abgenommenem Deckel in den Plattenleser ein und wählen Sie Platte einfahren. Klicken Sie auf Start und ein Fenster zum Speichern der Datei wird angezeigt. Benennen Sie die Datei um und klicken Sie auf Speichern.
Sobald die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät, und klicken Sie dann auf die Option Platte ausführen in, um das Lesegerät wieder einzusetzen. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Platte bis zur nächsten Messung wieder in den befeuchteten Inkubator. Nach einer, zwei und fünf Stunden der Behandlung zeigten die mit Rhosin behandelten Zellen keine signifikanten Veränderungen der Luziferase-Aktivität im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrollzellen.
Der Rac GTPase Inhibitor EHop-016 zeigte eine signifikant geringere Luciferase-Aktivität als DMSO. Mit ZCL278 behandelte Zellen wiesen zu allen drei Zeitpunkten eine signifikant geringere Luciferase-Aktivität auf als das Kontroll-DMSO. Luziferase-Aktivitäten, die ein, zwei und fünf Stunden nach der Behandlung gemessen wurden, zeigten eine dosisabhängige Reaktion.
Höhere Konzentrationen von ZCL278 zeigten immer noch signifikante Veränderungen im Vergleich zum Kontroll-DMSO.
