Diese Methode kann wichtige Fragen zur Phosphorylierung des Fünf-Prim-Endes von DNA- oder RNA-Molekülen durch eine spezielle Klasse von Enzymen beantworten, die als Polynukleotidkinase bekannt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Auflösung hat, sehr kleine Veränderungen in DNA- und RNA-Substraten zu erkennen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der RNA-Enzymkinase-Reaktionen.
Kombinieren Sie für jede Reaktion einen Mikroliter 500 nanomolarer RNA-Substrat. 8,3 Mikroliter 130 Nanomolar zuletzt, GRC drei und 0,2 Mikroliter von fünf Millimolar EDTA. Stellen Sie den Wärmeblock auf 37 Grad Celsius ein.
Mischen Sie dann 0,5 Mikroliter eines ATP-Unterbestands aus der Konzentrationsreihe mit einem RNA-Enzymgemisch und legen Sie die Reaktion auf den Wärmeblock. Mischen Sie die Reaktionen weiter und legen Sie sie in zehn Sekunden intervallen auf den Wärmeblock. Nach einer 60-minütigen Inkubation auf dem Wärmeblock, löschen Sie jede Reaktion, indem Sie es mit 10 Mikroliter Harnstoff-Ladefarbstoff.
Führen Sie sofort eine nachgelagerte Analyse durch oder speichern Sie die Reaktionen bei negativen 20 Grad Celsius, um zu einem späteren Zeitpunkt analysiert zu werden. Zur Herstellung einer 15%denaturierenden Acrylamid-Gel-Lösung 22,5 Milliliter vorgemischter 40%29 zu einer Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung kombinieren. Sechs Milliliter von zehn x TBE.
28,8 Gramm Harnstoff. Und RNase freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 Millilitern. Dann rühren Sie die Lösung vorsichtig.
Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle für 20 Sekunden. Rühren Sie es und geben Sie es sofort für weitere 20 Sekunden in die Mikrowelle zurück. Rühren Sie die Lösung vorsichtig, bis der Harnstoff vollständig gelöst ist.
Legen Sie den Glasbecher in ein flaches Wasserbad, das fünf Minuten lang kaltes Wasser enthält, und stellen Sie sicher, dass der Gehalt an kaltem Wasser, das den Glasbecher umgibt, über dem Niveau der Lösung im Inneren des Glasbechers liegt. Wenn die Lösung kühl ist, filtern und entgasen Sie sie mit einer Einwegfiltereinheit von 0,2 Mikrometern, um Partikel und mikroskopische Luftblasen zu entfernen. Waschen Sie eine kurze und lange Glasplatte mit Seife und Wasser, dann sprühen Sie jede Platte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas, um feuchtigkeit zu entfernen.
Heben Sie die lange Platte von der Bank oben, indem Sie sie auf eine Box legen. Positionieren Sie dann 0,4 Millimeter Abstandshalter entlang der langen Kanten der Platte. Legen Sie die kurze Platte auf die lange Platte, um sicherzustellen, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind.
Dann klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklemmen. 24 Mikroliter TEMED in die Acrylamidlösung geben und mischen. Dann 600 Mikroliter 10%APS hinzufügen und sofort die Lösung zwischen die Glasplatten gießen.
Das Gießen der Acrylamidlösung zwischen das Glasplatten-Sandwich kann wirklich eine Herausforderung sein. Um Luftblasen zu vermeiden, tippen Sie auf das Glasplatten-Sandwich, während Sie Ihre Lösung gießen. Fügen Sie vorsichtig einen sauberen 32-Well-Kamm an die Oberseite des Glasplatten-Sandwiches.
Und lassen Sie das Acrylamid für 30 Minuten polymerisieren. Um das Gel auszuführen, stellen Sie den Wärmeblock auf 75 Grad Celsius ein. Entfernen Sie die Metallklemmen.
Und gründlich waschen und trocknen Sie die Glasplatte Sandwich. Positionieren Sie das Plattensandwich und das Gelgerät mit der kurzen Platte nach vorne und bereiten Sie 0,5 X TBE Laufpuffer vor, indem Sie 100 Milliliter 10 X TBE mit 1,9 Literr RNase-freiem Wasser kombinieren. Fügen Sie 600 Milliliter des Laufpuffers in die oberen und unteren Kammern des Geräts.
Entfernen Sie den Kamm vorsichtig vom Gel und spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze ab. Führen Sie das Gel mit 50 Watt für 30 Minuten vor. Dann spülen Sie die Brunnen wieder ab.
Drehen Sie die Löschreaktionen und bebrüten sie drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Pulsspin und laden Sie sofort 10 Mikroliter jeder Probe auf das Gel. Dann laufen Sie das Gel für drei Stunden bei 50 Watt.
Wenn der Lauf beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Geräts. Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplatten-Sandwiches. Dann mit Folie bedecken und zur Bildgebung auf einen Laserscanner übertragen.
Montieren Sie das Glasplatten-Sandwich auf die Bühne des Laserscanners. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen für den gewünschten Boden für das Gel ein und stellen Sie es ab. Hier ist ein repräsentatives erfolgreiches Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge von zuletzt einem GRC drei Komplex gezeigt.
Die Zugabe des Enzyms führte zu einer letzten vermittelten RNA-Spaltung des Saccharomyces cerevisiae ITS zwei RNA-Substrat, was zu einem definierten RNA-Fragment führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch GrC3 PNK phosphoryliert. Um die Phosphorylierung des C2-RNA-Fragments zu visualisieren, wurde die relative Menge an nicht phosphorylierter und phosphorylierter C2-RNA gegen die ATP-Konzentration dargestellt.
Unser repräsentatives erfolgloses Denaturierungsgel wird hier gezeigt. Das 21 Nukleotid-RNA-Substrat enthielt Abbauprodukte, die sich mit dem phosphorylierten Produkt überlappten und eine genaue Quantifizierung der Phosphorylierung unmöglich machten. Im Gegensatz dazu konnte das kürzeste RNA-Abbauprodukt erfolgreich analysiert werden, da dieser Bereich des Gels keine zusätzlichen RNA-Arten enthielt, die eine genaue Quantifizierung seines phosphorylierten Gegenstücks behinderten.
Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Protokolls beachten sollten, ist, die Brunnen des Gels zu spülen, um eine gleichmäßige Belastung Ihrer Probe zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren konnte ein RNA-Umsatzexperiment durchgeführt werden. Um die Raten des RNA-Abbaus zu messen, signalisiert die Phosphorylierung oft die Initiierung des RNA-Abbaus.
Diese Technik ebnet den Weg für die Beantwortung detaillierter Fragen über die Aktivitätsspezifität und Kinetik von Polynukleotid-Kiinasen.
