Zu Beginn züchten Sie die Nicotiana benthamiana-Samen in feuchter Erde in einer kontrollierten Umgebung bei 23 Grad Celsius und 16 Stunden Licht, gefolgt von acht Stunden Dunkelheit. Nachdem Sie die zwei Wochen alten Sämlinge in größere Töpfe umgesiedelt haben, züchten Sie die Pflanzen vier bis fünf Wochen lang unter den gleichen Bedingungen, um sie auf die Agroinfiltrationsexperimente vorzubereiten. Streichen Sie Agrobacterium zu Mephasinen EHA105-Zellen, die die gewünschten Vektoren enthalten, auf LB-Agarplatten und inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius.
Nach zwei Tagen eine einzelne Kolonie von der Platte in zwei Milliliter LB-Brühe überführen und über Nacht bei 28 Grad Celsius unter Rühren bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Nehmen Sie dann einen Milliliter aus der Nachtkultur und fügen Sie vier Milliliter frische LB-Brühe hinzu, um sie eine Stunde lang unter den gleichen Bedingungen zu rekulturieren. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Danach wird die Zellzahl der Bakteriensuspension bei 600 Nanometern bestimmt und die optische Dichte mit Infiltrationspuffer auf 0,1 oder 0,2 eingestellt. Inkubieren Sie die Bakteriensuspension drei Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Als nächstes infiltrieren Sie die abaxiale Oberfläche von vollständig expandierten Blättern verschiedener Pflanzen mit einer nadellosen Ein-Milliliter-Einwegspritze.
Markieren Sie den infiltrierten Bereich, der dunkler erscheint als das umgebende, nicht infiltrierte Gewebe, mit einem wasserfesten Stift.
