We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Plasmidkonstruktion <ol><li> Generieren Sie die Konstrukte durch Technologie Klonen wie zuvor 1,6 beschrieben. <ol><li> Verwenden Sie zuerst eine High Fidelity DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primer die kodierenden Sequenzen von BASL zu verstärken, YDA und MPK6 und Unter klonen sie in Eintrag Vektoren. Hier finden Sie die ausführliche Protokoll in 7. </li><li> Um die dominant negative Versionen von MPK6 und YDA erzeugen (DNmpk6 8 und DNyda bzw. 4), verwenden Sie den Eintrag Plasmide von MPK6 und YDA als Matrize und einzuführen , um die Punktmutationen durch eine ortsgerichtete Mutagenese - Methode 9. </li></ol></li><li> Um die Konstrukte für Tabak transienten Assays bauen, führen Standard LR (attL x attR- Rekombination) Reaktionen (detailliertes Verfahren in 7) BASL in pH35CG zu integrieren 10, DNyda und DNmpk6 in pXNGW und pXCGW Vektoren 11. <ol><li> Bestätigen Sie die resultierenden Plasmide durch Enzym-Verdauung und Sequenzierung. Sobald successful, verwandeln die binären Konstrukte in die Agrobacterium - Stamm tumefaciens GV3101 12 und wachsen sie auf Selektionsplatten bei 28 ° C für 2 - 3 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Agrobacterium Infiltrationslösung <ol><li> Beimpfen einige frisch transformierten Agrobacterium - Kolonien in 10 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit geeigneten Antibiotika (Gentamycin 25 ug / ml, Rifamycin 25 ug / ml, Spectinomycin 100 ug / ml für pH35CG, pXNGW und pXCGW Konstrukten, die gleichen Konzentrationen Gentamycin und Rifamycin mit Kanamycin 50 ug / ml für P19 (Proteine ​​gegen transgenen Silencing exprimieren) 13. </li><li> Wachsen Agrobacterium - Kulturen in einem 28ºC - Schüttler mit der Geschwindigkeit von 200 Upm für etwa 16 h und messen dann die OD 600 (geschätzt zu erreichen 1,5-1,8) (2A-B). Spin down die Kulturen bei 2.500 × g für 10 min. Re-suspendieren und wash der Zellpellets mit 10 mM MgCl 2 (die Infiltrationslösung). </li><li> Spin down die Kulturen wieder und wieder aussetzen , die Pellets mit einer geeigneten Menge des Infiltrationslösung , die die endgültige OD 600 = 0,5 (2C-D) zu erreichen. Vor dem Pflanzen zu infiltrieren, lassen Sie die Zellmischungen bei Raumtemperatur mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt hilft Zellhomöostase zu halten. </li></ol> 3. Tabakpflanze Blatt Injection <ol><li> Verwenden Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) gewachsen 4 - 5 Wochen alten in einem Standard - Pflanzenwachstumskammer (23 ° C mit Zyklen von 16 Stunden Licht / 8 h-dunkel) 14 für Blatt Injektion. Anmerkung: In diesem Stadium Tabakpflanzen weisen in der Regel 6 Blätter (2 groß, 2 mittel und 2 klein). Die beiden mittelgroßen Blätter sind die optimal für die Blatt Injektion (die beiden Großen zu alt sind, während die beiden Kleinen oft zu jung sind). </li><li> Vor der Infiltration Tag, Wasser, um die tobacco Pflanzen, den Boden zu sättigen. </li><li> Auf der Infiltration Tag, Inkubation vorge die Pflanzen im Dunkeln mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt ermöglicht Stomata in der Epidermis weit zu öffnen, die groß die Agrobacterium erleichtert , wenn sie in den Blatt epidermalen Zellen eindringen. </li><li> Mit Farbbändern mit Daten gekennzeichnet, Fahne, um die Blätter infiltriert werden. (; Die infiltrierten Bereiche sichtbar sind nach infiziert optional.) Markieren Sie die Bereiche mit einem schwarzen dicken Sharpie zu infiltriert. </li><li> Nehmen Sie gleiche Volumina der Agrobacterium Resuspension und mischen sie in einem 100 x 15 mm Petrischale unter leichtem Schwenken (Abbildung 2E). Hinweis: In unserem Fall vermischt man 1 ml p19 mit 1 ml GFP-BASL, 1 ml DNyda-NYFP und 1 ml DNmpk-cYFP. </li><li> Im Prozess der Infiltration, eine 3 ml Spritze ohne Nadel mit dem Infiltrationsmischung füllen (1 - 2 ml) und schieben Sie in die Unterseite (abaxial) des Tabakblattes (2F). Während infiltrieren, ist es hilfreich,einer Hand zu bedienen zu schieben und die andere Hand sanft die Oberseite (adaxial, gegen die Schubkraft) zu unterstützen. Hinweis: Sobald die Infiltration Mischung erfolgreich injiziert wird, werden die infizierten Gebieten in der Epidermis leicht erkennbar werden. Jedoch kann die Infiltration nicht aufgrund der rauen Injektion (Gewebeschaden) oder unzureichende push (kein Eindringen von Flüssigkeiten). Für jeden Test schlagen wir mindestens zwei Einspritzungen in zwei unabhängige Blätter (von verschiedenen Pflanzen). </li><li> Legen Sie die infizierten Pflanzen wieder in die Wachstumskammer. Im Allgemeinen Proteinexpression nachweisbar sind nach 48 h folgende Infiltration. </li></ol> 4. Die konfokale Imaging <ol><li> Bei 48 Stunden nach der Infiltration, verwenden Sie ein Loch Puncher eine Blattscheibe aus dem injizierten Bereich auszuschneiden ( in der Regel 3 bis 4 Scheiben / Bereich erzeugt werden kann) (2G). Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Blattscheiben auf einen Objektträger übertragen (die abaxial Seite nach oben) und montieren sie mit Wassertropfen. Vermeiden Sie drücken zu hard auf dem Deckglas , weil gequetscht / geschädigten Zellen nicht gut zeigen unter dem konfokalen Mikroskop (Abbildung 2H). </li><li> Bevor die konfokale Abbildung, scannen die montierten Proben auf einer Epi-Fluoreszenz-Mikroskop Verbindung die Expressionsniveaus zu überprüfen. Hinweis: Basierend auf unserer Erfahrung, die Zellen, die Zwischenexpressionsniveaus zeigen, werden am besten unter dem konfokalen Mikroskop dargestellt. </li><li> Beginnen Sie mit dem 40X (NA 1.3) Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Stellen Sie die Folie in die gewünschte Position, so dass die Zellen mittlerer Ebenen fluoreszierendem Protein verbleiben im Zentrum ausdrückt. Die Anregungs- / Emissionsspektren für CFP und YFP sind 458 nm / 480-500 nm und 514 nm / 520-540 nm. </li><li> Aktivieren Sie die &quot;Live&quot;, um die Bilder dann in der Vorschau Laserintensität und intelligente Verstärkung für die ausgewogenste Fluoreszenzintensität / Rausch-Verhältnis einzustellen. Bildqualität, erhöhen Scan Pixel und / oder Rahmen / Linie Durchschnitt zu verbessern. Schließlich stellen Sie den Fokussierknopf zu reach die mittlere Fokusebene und klicken Sie auf &quot;Aufnahme&quot;, um das Bild zu nehmen. Hinweis: Die GFP und YFP Bilder können nacheinander oder gleichzeitig auf oder von der Option durch die Überprüfung von &quot;sequential&quot; Scan-Modus erfasst werden, respectively. </li><li> Wenn Z-Projektion für die in tiefen Einblick in die Zellen gewünscht, wählen Sie &quot;xyz&quot; Bildgebungsmodus definieren die Tiefe des Scanbereich (10 bis 15 &amp; mgr; m) und die Bilder von oben nach unten der Zielzelle sammeln . Stellen Sie die erhaltenen Bilder mit der Leica Software mit der rechten Maustaste auf die Bilddatei &quot;Umbenennen&quot; und Export von Bildern als TIFF-Dateien auszuwählen. </li><li> Bild 30 - 40 Zellen für die Quantifizierungsanalyse. </li></ol> 5. Bildverarbeitung und Quantifizierung Analyse <ol><li> Verwenden Sie Fidschi-Software (http://fiji.sc/Fiji) Bilder zu verarbeiten und die Quantifizierung durchzuführen. <ol><li> Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität Graphen. <ol><li> Um noch besser zu visualisieren, ob die CFP / YFP Ausdruckgleichmäßig verteilt, verwenden Fiji die Signalstärke von CFP und YFP entlang der Zellperipherie zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, starten Sie zuerst Fidschi wählen Sie dann &quot;Datei&quot; und &quot;Öffnen&quot;, um das Bild zu starten. Klicken Sie auf &quot;Linie&quot; auf dem Werkzeugmenü und wählen Sie &quot;Segmented line&quot; mit einem rechten Mausklick. Entscheiden Sie, die Region von Interesse und eine Linie entlang der Zellperipherie ziehen die GFP oder YFP - Signal (3A-C) zu verfolgen. Hinweis: Fidschi misst die absolute Fluoreszenzintensität Wert entlang der segmentierten Linien. </li><li> Wählen Sie das Dropdown-Menü &quot;Analysieren&quot; und &quot;Plot-Profil&quot;, um eine Grafik mit Position und Intensitätswerte erzeugen, die die Ebenen von CFP / YFP entlang der segmentierten Linie darstellen. Falls gewünscht, zu vervielfältigen, die Intensitätswerte (über das Menü &quot;Kopieren&quot; auswählen) in EXCEL oder andere Grafik-Software vergleichbarer Intensität Graphen zu erzeugen. </li></ol></li><li> Quantifizieren Polarität Grad. <ol><li> Sammeln Sie ca. 20 Vertretive Zellen von 3 Wiederholungsversuchen die Polarität Grad der CFP und YFP in Tabakzellen zu bewerten. Berechnen der Polaritätsgrad basierend auf dem Verhältnis der hohen Fluoreszenzintensität (definiert als H) über die niedrige Fluoreszenzintensität (als L definiert ist). Hinweis: Das Quantifizierungsverfahren ist in 3 erläutert. <ol><li> Um die H- und L-Werte zu messen, eine segmentierte Linie entlang der interessierten Region an der Zellperipherie ziehen (wie oben beschrieben), klicken Sie auf &quot;Analyze&quot; aus dem Drop-Down-Menü, und wählen Sie dann &quot;Messen&quot;. Wenn ein Fenster &quot;Ergebnisse&quot; erscheint, verwenden &quot;Mean&quot; Werte Quantifizierung durchzuführen. </li><li> Aus den Zellen eine relativ gleichmäßige Expression von GFP und YFP, zB GFP-BASL (3A) oder die YFP ergänzt von Co-Expression von DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3B), erhalten die H- und L - Werte Anzeige von Mess zwei zufällig periphere Segmente mit gleicher Länge ausgewählt. </li> &lt;li&gt; Aus den Zellen offensichtlich polare Ansammlung von fluoreszierenden Proteinen aufweisen, in diesem Fall ist die Co-Expression von GFP-BASL, DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3C), sammeln Sie die H - Werte aus den peripheren Regionen mit angereichertem Fluoreszenzsignale und die Ls aus den Regionen mit niedriger / kein Fluoreszenz Akkumulation. </li><li> Pool die sich ergebenden Verhältnisse von H / L aus 20 Zellen zusammen und Test auf Normalverteilung. Berechne die p - Werte durch den T - Test nach Student (für Normalverteilung) , oder die Kolmogorov-Smirnov (KS) Test (für Nicht-Normalverteilung). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Allgemeine Verwendung und mögliche Modifikationen des Transient Expression System Tabak für die Signalübertragung: Eine Überexpression von Fluoreszenzprotein (FP) -markierte Proteine ​​in den Tabak Epidermis wurde für die schnelle Untersuchung von Protein subzelluläre Lokalisierung in Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt. Jedoch ist das Studium dynamischer Signalverteilung der Proteinkomplex in planta ein herausforderndes Thema aufgrund der komplizierten subzellulär...

Proteine ​​interagieren innerhalb eines verwickelten hierarchischen Netzwerk und bilden Komplexe, die eine zentrale Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen in einer unvorhersehbaren zellulären Umgebung auftreten. Doch von der Entwicklung von Pflanzen Wachstumsreaktionen, hat es einen Mangel an praktischen Tools gewesen, die nicht nur schnell, sondern auch effizient zu identifizieren und diese dynamischen Signalereignisse auf subzellulärer Ebene überwachen. Die transiente Protein-Expressionssystem in Tabak Blattepidermis aufweist ansprechende Vorteile zur Visualisierung fluoreszierende Proteine ​​in lebenden Zellen. Dieses System bietet halb- in - vivo - Bedingungen , die post-translationalen Lokalisierung Proteinmodifikation und schnelle Untersuchung von Protein ermöglichen. Durch die Untersuchung informiert den ergänzt YFP-Signal, die bimolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Assay die Möglichkeit von Protein-Protein-Wechselwirkung in Pflanzenzellen. Im Vergleich zu anderen Methoden, beispielsweise Hefe-Zwei - Hybrid (Y2H) und co-immunoprecipitation (Co-IP), BIFC stellt auch ein mächtiges Mittel von Fächern zu visualisieren, wo Protein-Protein-Interaktionen auf subzellulärer Ebene auftreten können. Weil asymmetrische Zellteilung (ACD) Stammzellenpopulation beibehält , während neue Zelltypen für Gewebe- / Organbildung zu erzeugen, ist es ein unverzichtbarer Mechanismus für eukaryotische Vielzelligkeit fördern. Arabidopsis stomatal Entwicklung als Modellsystem verwendet wurde , für die Untersuchung ACD in Pflanzen. Die Vorläuferzelle, meristemoid Mutterzelle teilt sich asymmetrisch zwei verschiedene Tochterzellen zu erzeugen, eine meristemoid (erfährt zellähnliche Divisionen stammen, bevor sie in ein Paar von Schließzellen beendet) und einer Stomata Linie Grundzelle (SLGC) (dividieren kann und differenzieren sich in eine Fahrbahn Zelle), bzw. (Abbildung 1). In Stomata ACD wird das neue Protein Breaking of Asymmetry in der Stomata Lineage (BASL) polarisiert premitotically Division Asymmetrien zu fahren, die include physische Asymmetrie und Zellschicksal Asymmetrie 1. Eine MAPK Kaskade , bestehend aus dem MAPKKK YODA und den MAPK, MPK3 und 6 ist von zentraler Bedeutung für die Stomata Division Strukturierung und Schicksal Annahme 2,3, 4,5. Vor kurzem Zhang et al. die Polarität Protein BASL zur YDA-MAPK - Signalweg in Arabidopsis Stomata ACD 6 verbunden. Die kanonische YODA-MAPK-Weg, durch MPK3 / 6, phosphoryliert BASL und aktiviert seine Polarisation. Phosphoryliert BASL Funktionen als Gerüst und rekrutiert YODA (YDA) und MPK3 / 6 einen Proteinkomplex zu bilden , und die Signalisierung an der Zell cortex 6 konzentrieren. Polarisierung der MAPK-Komponenten und die positive Rückkopplungsschleife zwischen BASL und dem YDA-MAPK-Weg stellt einen neuen Mechanismus für die Protein Polarisierung in Pflanzenzellen. Vor Ort angereicherte MAPK - Signalisierung wird vermutet , eng mit Zellschicksal Differenzierung in Stomata ACD 6 (Abbildung 1) zu werden. Einer der key experimentellen Daten , die dieses Modell unterstützt kamen aus den Tabak Assays , die die räumliche Umverteilung von MAPKs durch die Expression von BASL 6 induziert demonstriert. Im allgemeinen ist es nicht leicht zu überwachen, wo MAPK Signalisierung tritt auf, weil MAPK Moleküle oft überall innerhalb einer Zelle gefunden wurden. In dieser Studie verwendeten wir die Split-YFP System die Wechselwirkung zwischen der stromaufwärts-Kinase und den stromabwärtigen visualisieren vorzuschlagen, wo die Melderelais auftritt. Wir verlängert weiter die Verwendung des BiFC System durch Co-Exprimieren eines dritten Protein (CFP-tagged) mit dem geteilten YFP Paar (suggestiv von Protein-Protein-Wechselwirkung) sichtbar zu machen, ob und wie die ergänzt YFP räumlich durch die co- moduliert werden könnten ausgedrückt GFP-Protein. Auf diese Weise haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von GFP-BASL induzierte räumliche Reorganisation von Wechselwirkungen zwischen YDA und MPK6, aus gleichmäßige Verteilung zu polarisierte Strukturierung an der Zellrinde des Tabak epidermal Zellen. Dieses System hat daher das Potential , zur Überwachung dynamischer Signalereignisse in Pflanzenzellen unter Bedingungen entwickelt werden , wenn die Zellen durch die internen oder externen Stimuli (zB Co-Expression von anderen Proteinen, chemischen Anwendung Pathogenbefall oder Umgebungsänderungen herausgefordert werden, etc. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

Visualisierung von dynamischen Signalereignisse in lebenden Zellen war eine Herausforderung. Wir erweiterten einen etablierten transienten Expressionssystem, wobei das biomolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Test in Tabak Epidermiszellen von Test Protein-Protein-Wechselwirkung, um die Überwachung der räumlichen Verteilung der Signaltransduktion in Pflanzenzellen. In diesem Protokoll verwendeten wir den BiFC Assay zeigen , dass die Wechselwirkung und die Signalisierung zwischen dem Arabidopsis MAPKKK YODA und MAPK6 an der Plasmamembran auftreten. Wenn das Gerüstprotein BASL wurde co-exprimiert, neu verteilt die YODA-MAPK-Interaktion und räumlich kopolarisierte mit GFP-BASL. Dieses modifizierte Tabakexpressionssystem ermöglicht eine schnelle Prüfung von Signal Lokalisierung und dynamischen Veränderungen (weniger als 4 Tage) und kann mehrere von fluoreszierenden Protein Farben (mindestens drei) aufzunehmen. Wir stellten auch detaillierte Methoden Proteinverteilung (asymmetrische räumliche Lokalisierung oder &quot;Polarisierung&quot; zu quantifizieren;) In Tabakzellen. Diese fortschrittliche Tabak-Expressionssystem hat ein Potenzial weit für einen schnellen Test der dynamischen Signalereignisse in lebenden Pflanzenzellen verwendet werden.

Um zu verhindern, induzierten Zelltod durch die hyperaktiv MAPK-Signalisierung, die Kinase-inaktiver Versionen YDA (DNyda) und MPK6 (DNmpk6) wurden in der Coexpression Assay in Tabakzellen verwendet. Weder die Interaktion zwischen DNyda und DNmpk6 enthüllt durch BIFC noch GFP-BASL selbst erzeugt ungleichmäßige Verteilung Muster (3A-B). Wenn jedoch GFP-BASL in die DNyda-DNmpk6 Wechselwirkungspaar eingeführt wurde, sowohl CFP und YFP - Signale wurden auf einer stark po...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Aufrufe.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Serie: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.