Diese Arbeit wurde ermöglicht durch eine National Science Foundation Career Award (MCB-0746066, Charakterisierung von Transkriptionsaktivatoren dass Emergent Verhalten zu regulieren), um RDW Wir sind dankbar, dass LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, und HG Taylor für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript.

Zubehör benötigt: <ul><li> Klett-Meter </li><li> Pipette und Spitzen </li><li> 2,5 ml Reaktionsgefäße </li><li> Microcentrifuge </li><li> CTTYE Medien: <ul><li> 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% Hefeextrakt (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM-Medien: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarose </li><li> Wasserbad gesetzt, um 55 ° C </li><li> Glasobjektträger </li><li> Große Deckgläser </li><li> 2 x 2 cm, 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (oder Etikettierung Band) </li><li> Zange </li><li> Kleine Binder Clips </li><li> Micro-Sampling Pipette (Fisher) </li><li> 100 ul Glas Einweg-Spitze (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Teil 1: Cell Preparation Erstellen Sie zunächst eine sterile Umgebung. <ul><li> Saubere Arbeitsbereich, don Handschuhe und Licht-Brenner. </li></ul><ol><li> Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Zellen durch Impfen in einen Kolben mit CTTYE Brühe und im Dunkeln inkubiert bei 32 ° C unter kräftigem Rühren. </li><li> Sobald die Kultur erreicht eine Dichte von 5 x 10 8 Zellen / ml, 1 ml Zellen in ein 2,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit). </li><li> Dekantieren und Überstand verwerfen. </li><li> Wash Zellpellet mit 1 ml TPM (Salz-ausgewogene, nährstoffreiche freien Medien). <ul><li> resuspendieren und vortexen </li></ul></li><li> Re-Pellet-Zellen durch Spinnen für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit). </li><li> Dekantieren und Überstand verwerfen. Entscheidender Schritt </li><li> Komplett neu einzustellen Pellet in 100 ul TPM Medien mit einer Kombination aus Pipettieren und Vortexen. WICHTIG: Dieser Schritt stellt sicher, dass es keine Zellklumpen in die Röhre gelassen. Dies kann eine Weile dauern. </li><li> Stellen Sie die Zellen neben bei Raumtemperatur während der Vorbereitung der Tracking-Assay-Platten. </li></ol> Teil 2: Agar Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 50 ml der beiden TPM (Assay Medien) und CTTYE (nutritive Disk)-Medien. </li><li> Geben Sie 0,5 g Agarose jedem (Agarose ist weniger als diffraktive Agar). </li><li> Autoklaven sterilisieren. </li><li> Nach der Sterilisation, pflegen die Medien bei 55 ° C in einem Inkubator (oder Wasserbad) beim Bau des Tracking Assayplatte Komplexe. </li></ol> Teil 3: Nutritive Disk-Bau <ol><li> Legen Sie eine sterile 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung auf einer Flamme sterilisiert Glasobjektträger und bilden eine kleine, gut. </li><li> Pipette ~ 300 ul der 55 ° C CTTYE media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf der Folie erstellt und enthält die Nährstoffe speichern. Die CTTYE media / Agarose sollte Erdhügel auf. </li><li> Legen Sie eine Flamme sterilisiert slide (ohne Dichtung) auf der Oberseite des CTTYE media / Agarose. WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. </li><li> Sobald die Schiene ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite. </li><li> Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen die CTTYE media / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min. </li></ol> Teil 4: Tracking Assay Vorbereitung - Set Up Platte Komplexe Montieren Sie die Komponenten, bereiten Sie das Dia-Komplexe, legen Sie die nutritive Festplatte, gießen Sie die TPM media / Agarose, separate und trocknen Platte Komplexe, Platten-Zellen, und montieren Tracking Assayplatte Komplexe. Montieren Platte komplexe Bauteile <ol><li> Für jedes komplexe, schwer einen Glasobjektträger sterilisiert </li><li> Ein autoklaviert Dichtung am oberen Rand der Folie und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies bildet den Boden des Assays. </li><li> Flamme sterilisieren ein Deckglas und legen Sie es auf einem zweiten Glas Objektträger mit Kennzeichnung Band (oder Parafilm) gewickelt und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies ist als Unterstützung Folie, um das Deckglas vor Rissen zu halten verwendet. Diese bilden die Spitze des Assays. </li><li> Flamme sterilisieren ein Drittel Glasobjektträger und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies wird verwendet, um die Agarose abflachen werden. WICHTIG: Sicherstellen, dass die Dichtungen eine Abdichtung mit dem Glas, indem Sie ihn mit einer Pinzette, da sonst die media / Agarose kann austrocknen. </li></ol> P<html> Spitzen nutritive Festplatte WICHTIG: Schritte 5 bis 10 muss auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt erfolgen, da sonst die media / Agarose konnte beginnen sich zu verfestigen, was zu schlechter Bildqualität. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die nutritive Festplatte komplexe Form 4 ° C (Schritt 5 von Teil 3) und hebeln auseinander Folien Freilegung der nun verfestigt CTTYE / Agarose. </li><li> Entfernen eines 1 mm Durchmesser &quot;nutritive disk&quot; aus dem CTTYE media / Agarose auch oben mit einem Mikro-Probenahme-Pipette mit einer 100 ul Glas Einweg-Spitze beschrieben und legen Sie sie in die gut von der Dichtung auf das Deckglas (Schritt 3 oben) erstellt . </li></ol> Platten gießen Entscheidender Schritt <ol start="7"><li> Pipette ~ 300 ul der 55 ° C TPM media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf dem Deckglas und mit den nahrhaften Festplatte erstellt. Die TPM-media / Agarose sollte Erdhügel auf. Entscheidender Schritt </li><li> Legen Sie die Flamme sterilisiert slide ohne Dichtung (aus Schritt 3) auf der Oberseite des TPM media / Agarose. WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. </li><li> Sobald die Folie (aus Schritt 5) ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite. </li><li> Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen den Medien / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min. </li></ol> Separate und trocken Platten WICHTIG: Um die Medien / Agarose vor dem Austrocknen zu verhindern, die Schritte 11 bis 20 sollten nur auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden. WICHTIG: Für beste Ergebnisse, die Schritte 11 bis 13 sollte bei 4 ° C durchgeführt werden <ol start="11"><li> Nachdem die Medien / Agarose gesetzt hat, entfernen Sie das Bindemittel Clips und drücken Sie die Ende des Komplexes um das Band-gehüllt gleiten zu lösen. </li><li> Entfernen Sie das Klebeband umwickelt-Rutsche und legen Sie es auf der Bank zur weiteren Verwendung. Entscheidender Schritt </li><li> Mit einer Pinzette wie ein Keil, separate das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex von der Support-Folie (ohne Dichtung) und entsorgen Sie die Unterstützung gleiten. WICHTIG: Verwenden Sie keine neugierigen Bewegung das Deckglas / Dichtung komplexen trennen. Dies könnte in das Deckglas zu brechen und / oder der Medien / Agarose Festhalten an der Unterstützung Rutsche führen. </li><li> Legen Sie das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex auf dem Band-gehüllt slide (Dichtung nach oben) und entfernen von 4 ° C. Legen Sie diese komplexe neben einem Brenner, damit alle sichtbare Feuchtigkeit aus den neu freigelegten media / Agarose Oberfläche verdunsten - nicht mehr als 1 min. WICHTIG: Lassen Sie sich nicht den Medien / Agarose trocken zu lange, da dies Auswirkungen auf die M. xanthus Schwarmverhalten. </li></ol> Platte Zellen Entscheidender Schritt <ol><li> Nachdem die überschüssige Feuchtigkeit verdunstet ist, Pipette 0,5 ul der konzentrierten Zellen (Schritt 8 aus Teil 1) auf das Medium / Agarose ca. 1 mm von der Nährstoff-Festplatte. WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen, indem Sie die Pipette senkrecht nach unten und dann gerade nach oben abgelegt werden. Dies gewährleistet, dass der Schwarm wird kreisförmig sein. WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, nicht die Pipettenspitze an die Medien / Agarose berühren. Dies wird eine Depression auf der Oberfläche zu machen und das Verhalten des M. xanthus Schwarm. TIPP: Halten Sie die Pipette vor Annäherung an die Medien / Agarose. Dies ermöglicht einen Rückgang von Zellen auf der Unterseite der Pipettenspitze erscheinen und machen es leichter, die Zellen zu hinterlegen. </li><li> Sobald die Zellen abgeschieden werden, statt sich der Komplex neben dem Brenner, damit die Zelle vor Ort, um zu trocknen - nicht mehr als 20 sek. </li></ol> Assemble-Test <ol><li> Sobald die Zelle vor Ort getrocknet ist, richten Sie die Folie / Dichtung Komplex (aus Schritt 1) ​​mit der Dichtung auf das Deckglas / Dichtung / media / Agarose / Zelle-Komplex (aus Schritt 13) und sanft zusammen drücken, um eine Dichtung zu bilden. Entscheidender Schritt </li><li> Reinigen Sie die Oberflächen der Folie und Deckglas mit einem Kimwipe dem Rückstand durch den Parafilm links entfernen. Der ausgefüllte Test sollte Abbildung 1 ähneln. </li><li> Legen Sie das ausgefüllte Dia-Komplex auf der beheizten Bühne bei 32 ° C gehalten (nach unten rutschen, Deckglas nach oben) unmittelbar nach abwischen (Schritt 15), um Kondensation bilden bildung zu verhindern. Wenn sich Kondensation gebildet hat, lassen Sie schieben komplexen sitzen auf der beheizten Bühne für einige Sekunden vor dem Start der Bildaufnahme-Software. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Ziel (2X, 4X oder 10X). </li></ol> Teil 5: Movie Vorbereitung t &quot;&gt; entscheidender Schritt <ol><li> Schalten Sie die Kamera und Mikroskop, und überprüfen Sie die Lichtverhältnisse (stellen Sie sicher, das Licht nicht zu intensiv). Starten Sie den Computer und öffnen Sie die Bildaufnahme-Programm. </li><li> Klicken Sie auf das Live-Bild-Fenster und Fokus des Mikroskops. Das Bild sollte in etwa dem in Abbildung 3 zu sehen. Beachten Sie die einheitliche Agaroberfläche. </li><li> Starten Erfassen von Bildern. Entscheidender Schritt </li><li> Prüfen Sie die Fokussierung regelmäßig während der ersten Stunde, wie die Medien / Agar neigt sich absetzen was den Fokus auf Drift. </li><li> Saubere Arbeit Bereich. </li><li> Nach der Bildaufnahme beendet ist, erworben Übertragung von Bildern für die Lagerung und zum Abbau der Rutsche Komplex durch Einweichen in 90% Ethanol über Nacht. </li><li> Autoclave Dichtungen für die Wiederverwendung. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Cartoon Illustration der TM Platte komplex. (A) zeigt den prinzipiellen TM Platte Komplex in Explosionsdarstellung und Querschnitt. (B) zeigt die Verwendung von größeren Dichtungen. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Mikroskop-Cluster. Jedes Mikroskop Knoten (kleines Bild) besteht aus einer Nikon E400 Mikroskop, Ziele, einen beheizten Bühne, ein Insight-Kamera und ein Notebook. Jeder Knoten ist vernetzt und verbunden mit einem Master-Controller-Computer. Zwei der Knoten sind mit Fluoreszenz-Funktionen, die der EXFO Lichtquelle und zwei Uniblitz Fensterläden bestehen gesetzt. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. A 20X Bild von Tracking-Test Gerät zum Zeitpunkt = 0 ist. Scale-bar, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Anpassungsfähigkeit der TM Platte komplex. (A) eine 100x Bild von M. xanthus Gleiten Motilität auf CTTYE in 1,0% Agar. (B) einen 20X Bild von P. aeruginosa Zucken Motilität. (C) einen 20X Bild S. marcescens Schwärmen Motilität. Beide (B) und (C) wurden auf LB in 1,0% Agar untersucht. (D) ein 40X Bild von M. smegmatis Schiebetüren Motilität auf LB in 0,5% Agar. Dieses Bild wurde aufgenommen mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B. Video 1. Ein Zeitraffer-Video eines Schwarms unterzogen, um die Tracking-Test. Video 2. Ein Zeitraffer-Video eines M. xanthus Schwarm, wo 1% der Zellen sind fluoreszenzmarkierten. Wechselnde Phasen-Kontrast-und Fluoreszenz-Bilder wurden gefangen genommen und überlagert werden, um die Position der fluoreszierenden Zellen innerhalb des Schwarms zu erläutern. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen. Video 3. Ein Zeitraffer-Video von M. xanthus Gleiten Motilität. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen. Video 4. Ein Zeitraffer-Video von P. aeruginosa Zucken Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen. Video 5. Ein Zeitraffer-Video von S. marcescens Schwärmen Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen. Video 6. Ein Zeitraffer-Video von M. smegmatis Schiebetüren Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 0,5% Agar mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B erfasst.

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	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

Zeitraffer-microcinematography (TM) hat sich zu einem Standard-Ansatz zur Untersuchung prokaryotischen Motilität 2-7. Traditionell wird TM mit Filterpapier Dochte, dünne Agar-Pads, oder Agar Platten als Substrate 8-11 durchgeführt. Diese Methoden sind ausreichende und kostengünstige, wenn verwendet, um Bildsequenzen für allgemeine Illustrationen von bakteriellen Bewegung zu erzeugen. Allerdings, wenn Bildsequenzen müssen bei der Erzeugung von reproduzierbaren und quantitativen strengen Daten ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

Ein Schwarm der δ-Proteobakterium Myxococcus xanthus enthält Millionen von Zellen, die als Kollektiv, die Koordination der Bewegung durch eine Reihe von Signalen bis hin zu komplexen, dynamischen Muster als Reaktion auf Umweltreize zu schaffen zu handeln. Diese Muster sind sich selbst organisierende und emergente, sie können nicht durch die Beobachtung des Verhaltens der einzelnen Zellen vorhergesagt werden. Mit einem Zeitraffer-microcinematography Tracking-Assay identifizierten wir eine deutliche emergent Muster in M. xanthus als Chemotaxis, definiert als die gerichtete Bewegung von einem Schwarm eine Nährstoff-Gradienten in Richtung seiner Quelle 1. Um effizient zu charakterisieren Chemotaxis über Zeitraffer-microcinematography, entwickelten wir eine stark modifizierbar Platte Komplex (Abbildung 1) und konstruiert ein Cluster von 8 Mikroskope (Abbildung 2), die jeweils für den Fang von Zeitraffer-Videos. Der Test ist streng genug, um konsistente Replikation von quantifizierbaren Daten zu ermöglichen, und die daraus resultierenden Videos ermöglichen es uns, zu beobachten und zu verfolgen subtile Veränderungen in Schwarmverhalten. Einmal erfasst, sind die Videos auf einer Analyse / Lagerung Computer mit genügend Arbeitsspeicher zur Verarbeitung und Speicherung Tausende von Videos übertragen. Die Flexibilität dieser Einrichtung hat sich bewährt, mehrere Mitglieder der M. xanthus Gemeinschaft.

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Zur Untersuchung<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Schwarmverhalten, haben wir ein Zeitraffer-microcinematography Protokoll, das für verschiedene Tests modifiziert werden kann konzipiert. Das Unternehmen beschäftigt Standard Wachstumsbedingungen für die Mikroskopie geeignet und liefert reproduzierbare Ergebnisse durch den Einsatz von kostengünstigen und wiederverwendbaren Silikon-Dichtungen. Wir haben diese Methode verwendet, um vielzelligen Chemotaxis zu quantifizieren.

Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K Aufrufe.  University of South Carolina (USC). Zur Untersuchung Myxococcus xanthus Schwarmverhalten, haben wir ein Zeitraffer-microcinematography Protokoll, das für verschiedene Tests modifiziert werden kann konzipiert. Das Unternehmen beschäftigt Standard Wachstumsbedingungen für die Mikroskopie geeignet und liefert reproduzierbare Ergebnisse durch den Einsatz von kostengünstigen und wiederverwendbaren Silikon-Dichtungen. Wir haben diese Methode verwendet, um vielzelligen Chemotaxis zu quantifizier...

Serie: Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...