Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern im kraniofazialen Bereich, kollektive Bewegungsattribute in Kontroll- und Mutantenzellen quantitativ zu vergleichen, um den mesenchymalen Umbau während der palatalen Regalerhöhung zu verstehen. Die Verwendung primärer embryonaler palataler mesenchymaler Zellen der Maus und die Zeitraffer-Bildgebung bieten eine zugängliche Proxy-Methode zur Beurteilung der Gaumenregalhöhendynamik. Um Gaumenschalen aus einem Mausembryo zu entnehmen, verwenden Sie einen sterilisierten perforierten Löffel, um einen embryonalen Day 13,5 Embryo in eine sterile 10-Zentimeter-Schale zu legen, die mit sterilem MEPM-Kulturmedium unter einem Stereomikroskop gefüllt ist.
Führen Sie nach der Enthauptung eine Spitze einer sterilisierten feinen Pinzette Nr. 5 in den Mund direkt in der Wange ein und drücken Sie die Spitze der Pinzette, bis sie die Rückseite des Schädels verlässt. Richten Sie die Pinzette so aus, dass der andere Arm knapp über dem Gehörgang schwebt, bevor Sie die Pinzette zudrücken, um das Gewebe zu schneiden. Wiederholen Sie den Schnitt auf der anderen Seite des Kopfes und setzen Sie das Pinch-Cut-Verfahren fort, bis der Unterkiefer, die Zunge und der untere Teil des Schädels entfernt wurden, wobei die Gaumenregale freigelegt wurden.
Wenn der Kopf auf die Seite gelegt ist, positionieren Sie die Spitzen einer kleinen, sterilen Edelstahlschere vor und hinter dem Schädel nur etwa auf Augenhöhe des Embryos und schneiden Sie knapp über den Augen, um den Schädel des Schädels zu entfernen, wodurch eine flache Oberfläche entsteht. Als nächstes positionieren Sie den Kopf kopfüber mit dem oberen Aspekt, der flach auf dem Boden der Schüssel ruht, und lokalisieren Sie die Palatalregale, die als zwei erhöhte Brücken auf beiden Seiten der zentralen Rille in der vorderen Hälfte des Kopfes sichtbar sein sollten. Um den Kopf an der Schale zu befestigen, führen Sie eine Spitze einer feinen Pinzette durch das Gewebe in der Nähe der Nasenregion des Kopfes anterior zu den Palatalregalen und die andere durch die Basis des Schädels nach hinten zu den Palatalregalen ein.
Führen Sie beide Punkte eines zweiten Paares einer sehr scharfen, feinen Pinzette in das Gewebe an der Basis der seitlichen Oberfläche des Regals ein und kneifen Sie langsam und vorsichtig, um das Gewebe zu schneiden. Wiederholen Sie den Schnitt entlang der Basis der medialen Oberfläche des Regals und sowohl am vorderen als auch am hinteren Ende des Regals, um das Regal von seiner Befestigung am Kopf zu lösen, heben Sie dann das Regal vorsichtig an und machen Sie bei Bedarf zusätzliche Pinchs, um die Schale vollständig vom umgebenden Gewebe zu befreien. Wenn das zweite Palatalregal auf die gleiche Weise entfernt wurde, verwenden Sie eine sterile Kunststoffkolben-Transferpipette, um die Regale in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in etwa 500 Mikroliter PBS auf Eis zu übertragen.
Um eine MEPM-Zellkultur einzurichten, wenn alle Regale gesammelt wurden, aspirieren Sie das PBS, ohne das Gewebe zu stören, und fügen Sie sofort 200 Mikroliter von 37 Grad Celsius 0,25% Trypsin zu jedem Röhrchen palatalem Regalgewebe hinzu. Verwenden Sie eine 1.000 Mikroliter Pipette, um das Gewebe einige Male kurz zu pipettieren und das Gewebe für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, wobei Sie nach fünf Minuten kurz pipettieren. Am Ende der Inkubation pipettieren Sie die Gewebe erneut, bevor Sie jedem Röhrchen 800 Mikroliter MEPM-Kulturmedium hinzufügen und die Röhrchen zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln.
Nach dem Absaugen des Überstandes werden die Pellets in einem Milliliter frischem MEPM-Kulturmedium pro Röhrchen resuspendiert und die Zellen in einzelne Vertiefungen einer mit Sechs-Well-Gewebekultur behandelten Platte mit zwei Millilitern pro Vertiefung zu einer endgültigen Gesamtsumme von drei Millilitern pro Vertiefung geklebt, dann lassen Sie die Zellen 12 Stunden lang in einem sterilen Zellkultur-Inkubator an der Kunststoffoberfläche haften. Um einen 2D-Sammelmigrationsassay einzurichten, entfernen Sie die Oberseite eines sterilen Zwei-Well-Silikoneinsatzes für jede zu analysierende Probe auf eine Höhe von etwa einem Millimeter und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die verkürzten, sterilen Zwei-Well-Einsätze in die Mitte einzelner Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte zu platten. Drücken Sie entlang aller Kanten nach unten, um sicherzustellen, dass die Einsätze vollständig auf den Bohrlochböden haften, und säen Sie 300 MEPM-Zellen pro Quadratmillimeter der verkürzten Silikoneinsätze in einem Gesamtvolumen von 40 bis 50 Mikrolitern MEPM-Kulturmedium in jeden Einsatz für eine über Nacht inkubation im Zellkulturinkubator.
Um einen Wundreparaturassay einzurichten, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um einen unveränderten sterilen Zwei-Well-Silikoneinsatz in die Mitte eines Bohrlochs einer Sechs-Well-Platte pro Probe zu legen und die Kanten des Einsatzes fest zu drücken, um den Einsatz an der Kulturplatte zu befestigen. Dann säen Sie 1.400 Zellen pro Quadratmillimeter in 100 Mikroliter MEPM-Kulturmedium in jede Einlage und inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden im Zellkulturmedium. Bei der Durchführung eines 2D-Kollektivmigrationsassays bietet das Aussaaten der Zellen in Zwei-Well-Silikoneinsätzen in einer großen Kulturschale typischerweise eine bessere Zelldichte für die Bildgebung.
Kleine 3D-gedruckte Ringe, die in einer 35-Millimeter-Schale platziert sind, können auch für die 2D-Motilitätsanalyse verwendet werden. Für Wundreparaturassays werden die Zellen in Zwei-Well-Silikoneinsätzen bis zu einem hohen Zusammenfluss gezüchtet. Die Einsätze werden dann entfernt und die Wunde wird bis zum Schließen abgebildet.
MEPM-Trajektorien sind persistent und die Richtung der Zellmotilität wird für mehrere Stunden aufrechterhalten. Die Mittlere Verschiebungs-Zeit-Analyse zeigt, dass die Persistenz in Form von Verschiebung proportional zur verstrichenen Zeit ist. Die Flussanalyse der Motilitätsdaten zeigt, dass die sich bewegenden MEPM-Zellcluster etwa 300 Mikrometer groß sind.
Ein tiefgreifender Motilitätsunterschied zwischen Wildtyp- und mutierten MEPM-Zellen wird ebenfalls beobachtet. Dieses Verfahren könnte an verschiedenen transgenen Mauslinien und zur Behandlung von MEPM-Zellen mit verschiedenen biochemischen Reagenzien eingesetzt werden, um ihre Auswirkungen auf die Zellbewegung zu untersuchen. Wir haben uns auf primäre palatale Mesenchymzellen konzentriert, aber die Zeitraffer-Bildgebung und quantitative Analysen können auch verwendet werden, um die Migrationsattribute jedes beweglichen Zelltyps in dynamischen Entwicklungsprozessen zu untersuchen.
