Diese Forschung wird von der National Research Foundation und Bildungsministerium Singapur unter seinem Forschungszentrum der Excellence-Programm unterstützt, das Start-up Grants (M4330002.C70) aus Nanyang Technological University und ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) vom Ministerium für Bildung, Singapur. Die Autoren danken Joey Yam Kuok Hoong für die Teilnahme an der Demonstration dieses Protokolls.

1. Biofilm Anbau <ol><li> Zubereitung von Bakterienstämmen <ol><li> 1 Tag vor Biofilm Anbau, vorzubereiten planktonischen Bakterienkulturen durch Inokulation von 2 ml geeigneten Wachstumsmedium aus gefrorenem Bakterienkultur. Verwenden Luria-Broth-Medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 Hefeextrakt und 10 g L -1 Trypton) zum mucoid P. aeruginosa und dessen Δ pel und Δ psl Defektmutanten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 200 rpm schütteln Bedingungen. Verdünnte-Nacht-Kulturen auf eine OD600 von 0,40 unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Montieren Flusszelle Setup, die zuvor beschrieben worden, 14 hat, vorzugsweise auf einer Mobilstation oder Wagen, die in das Mikroskop Raum zur Abbildung des Flusszelle ohne Demontage gebracht werden kann. </li><li> Bereiten Sie sterile Wachstumsmedium in 2 l oder 5 l-Flaschen für jeden Durchflusszelle. Verwenden Minimalmedium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 und 0,1 mM CaCl 2) mit 0,04% Glucose (G / V) und 0,2% (G / V) Casaminosäuren) von P. ergänzt aeruginosa Flusszelle Biofilmen. </li><li> Aliquot fluoreszierende Mikrosphären in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-down in sterilem H 2 O für 5 min in Zentrifuge bei 9,391.2 g. Überstand abnehmen und resuspendieren in 1 ml Wachstumsmedium zu Natriumazid (Desinfektionsmittel) vor der Zugabe zum Kulturmedium in 2 L oder 5 L-Medium Flaschen zu entfernen. HINWEIS: Verschiedene Größen der Mikrokugeln in verschiedenen Konzentrationen und sollte entsprechend den Anweisungen verdünnt werden. Beispielsweise dispergieren 120 ul von 1,0 um Mikrokügelchen Durchmesser von 15 &amp; mgr; l von 0,5 um Mikrokügelchen Durchmesser und 0,96 &amp; mgr; l von 0,2 um Mikrokügelchen Durchmesser in 2 l Wachstumsmedium auf 2,18 × 10 6 ml -1 Mikrokügelchen für jede Partikelgröße zu ergeben. </li><li> Bringen Medium Flasche UpstRies Flusszelle und lassen Wachstumsmedium durch gesamte Setup. Gasaustritt stoppen und injizieren verdünnten Übernachtkulturen in Flusszelle Kammern. Dass Bakterien auf das Deckerde für 1 h vor dem kontinuierlichen Fluss von Wachstumsmedium bei einer Flussrate von etwa 5,5 x 10 -3 m sec -1 oder 8 min mit einer peristaltischen Pumpe zu befestigen. HINWEIS: Biofilme werden gewöhnlich bei Raumtemperatur (25 ° C) für 3-7 Tage gezüchtet. </li><li> Alternativ zur statischen Kultur Setup, verdünnte Übernachtkulturen 100-fach in Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 10 ul der Übernachtkultur auf 1 ml Wachstumsmedium mit Partikeln. Erhöhung der Partikelkonzentration im Wachstumsmedium für die statische Anzucht von etwa 500-fache im Vergleich zu derjenigen für die Strömung von Biofilmen (zB waschen und resuspendieren, 600 &amp; mgr; l von 1,0 um Kugeln mit einem Durchmesser von 10 ml Wachstumsmedium), wie Durchflußzelle Biofilme ständig nachgefüllt Partikel, aber statischen Kulturen sind es nicht. <ol><li> In 2001; l des verdünnten Übernachtkultur mit Partikeln in die Kammern 8 und Folien. Inkubieren bei 37 ° C unter statischen Bedingungen. Biofilme sind in der Regel für 1 Tag gewachsen. Ersetzen Sie verbrauchte Nährmedium täglich mit frischem Wachstumsmedium mit Partikeln, wenn Biofilm ist für mehr als 1 Tag gewachsen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mikroskopie <ol><li> An Tag 3 und 5, schalten Sie Flow aus der Schlauchpumpe und bringen Flusszelle Setup in die Mikroskopie Raum. Clamp Schlauch nahe dem Eingang und Ausgang der Durchflusszelle Kammern Drift (eine systematische Fehlerursache durch Veränderungen in der Umwelt) vom Fluss zu verhindern. Setzen Sie die Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch von einem aufrechten Mikroskop. HINWEIS: Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop zur Abbildung von Mikrovertiefungen. </li><li> Verwenden Fluoreszenzmikroskopie mit 40x Öl-Objektiv, um Videos von Mikrosphärenbewegung im Biofilm an verschiedenen Standorten (Mikrokolonien und Flach undifferenzierten Schichten) eingebettet und in unterschiedlichen Tagen (Tag 3 und 5), um zu nehmenzeitliche und räumliche Untersuchungen. Nehmen Sie kürzere Videos mit höheren Bildrate, um Ereignisse in kurzen Zeitskalen auftreten untersuchen (zB 1,5 bis 3 min Video Framerate von 25-50 Frames pro Sekunde für schnelle Dynamik) und längere Videos mit niedriger Bildrate, um Ereignisse über längere Zeit zu untersuchen Waagen (zB 15-30 min Video Bildrate von 2,5 bis 5 Bilder / s für langsamere Dynamik). HINWEIS: Ein Video enthält typischerweise 5-10 Partikel und ist in der Regel von 1,0 bis 2,5 GB in der Dateigröße. Größere Mikrokolonien können mehr Teilchen zu halten. Nehmen Sie 5-10 Videos für die einzelnen Kategorien (zB 5-10 Videos von verschiedenen Mikrokolonien und von verschiedenen Orten in flachen undifferenzierten Schichten). Der Biofilm hat eine heterogene Architektur, die von Mikrokolonien, Kanäle, Hohlräume und Flach undifferenzierten Schichten bestehen kann. </li><li> Speichern Sie Ihre Videos in geeigneten Format, das von Fiji / ImageJ gelesen werden können (zB CZI, tif). </li><li> Überprüfen Sie Videos für Drift durch Scrollen durch fertige video und der Beobachtung, dass die Partikel nicht in derselben Richtung gleichzeitig zu bewegen. Drift kann durch z-Tischbewegung, Ströme in der Strömungszelle, Ungleichgewicht der Antischwingungstisch, Luftdruck- oder Temperaturänderungen hervorgerufen werden. Correct kleinere treiben mit Post-Processing-Techniken in der Regel mit Mikroskop-Software zur Verfügung gestellt. Entsorgen Sie alle Videos, bei Drift kann nicht korrigiert werden. Nehmen Sie die folgenden Parameter, die während der Particle Tracking-Analyse erforderlich sind: Auflösung (Pixel / um), Anzahl der Frames, Dauer. </li><li> Entfernen Sie Durchflusszelle von Mikroskoptisch, und starten peristaltische Pumpe weiter Kultivieren des Biofilms. </li></ol> 3. Particle Tracking Analysis <ol><li> Erhalten Teilchenbahnen mit Hilfe des Plug-in-Trackmate in Open Source Software (ImageJ). Laden Fiji bei <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Öffnen Sie das Video mit Fidschi und unter dem Plugins-Menü Verfolgung und Trackmate. </li><li> Prüfen oder Einstellungen anzupassen in thE-Fenster darauf hindeutet anfänglichen Kalibrierungseinstellungen, um die Videoparametern entsprechen, wie in Schritt 2.4 aufgezeichnet. </li><li> Detect Partikel in Trackmate mit ImageJ. <ol><li> Wählen Sie &#39;Log-Detektor &quot;, Eingangspartikeldurchmesser und Schwellenwert (zB 1000). Blättern Sie durch das Video, während Sie auf &#39;Vorschau&#39;, um zu überprüfen, dass die lila Kreise folgen Sie den Teilchen in der gesamten Video. Passen Sie die Werte Durchmesser und Schwellen wie nötig: Erhöhung des Schwellenwerts, wenn lila Kreise in den leeren Raum angezeigt. Reduzieren Sie den Schwellenwert, wenn nicht genug Partikel festgestellt werden. Klicken Sie auf Weiter, um den Nachweis führen Sie die Partikel. </li><li> Klicken Sie auf Weiter, wenn mit der Option präsentiert, um hinzuzufügen oder Partikel in &#39;Initial Schwellen&#39; erkannt zu entfernen, &#39;Wählen Sie eine Ansicht &quot;und&quot; Wählen Sie einen Filter &quot;Fenster, um ohne Einstellung fortzusetzen, wenn anfängliche Partikeldetektion war zufriedenstellend. </li><li> Wählen Sie &quot;Einfache LAP-Tracker&quot; in der optiauf Leiste &#39;Wählen Sie ein Tracker-Methode &quot;Fenster als Partikel nur selten aus der Schwerpunkt in den Biofilm zu bewegen und sind leicht verfolgt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen oder niedrigen Verknüpfung und Lückenschließung max Abstandswerte, und klicken Sie auf Weiter. </li><li> Überprüfen Sie, dass Partikelverfolgung ist durch Scrollen durch das Video zu sehen, dass Partikel folgen Sie den von Trackmate gezogen Tracks, und dass es keine unerwünschten oder fehlende Tracks zufriedenstellend. Überspringen Sie die verschiedenen Filterschritte. Zum letzten Fenster &quot;Wählen Sie eine Aktion&quot;. Wählen Sie &quot;Export Tracks auf XML-Datei&quot; aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Wählen Sie einen Ordner, um die Titel zu speichern. HINWEIS: Es gibt verschiedene Programme zur Verfügung, in der Öffentlichkeit für die Analyse der Partikelbahnen und die Verwendung von Mikrorheologie. msdanalyzer und TrackArt sind Beispiele für Partikel-Tracking-Analyse-Programme, die in der Matlab-Umgebung ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Bereiten Matlab, um die Partikelbahnen in den XML-Dateien, indem Sie im Menü des importierenMatlab Datei&gt; Pfad ... und fügen Sie die Skripts Ordner mit der Fidschi-Paket. </li><li> Um die Partikelbahnen mit msdanalyzer analysieren, laden Sie den Link auf die ZIP-Datei oder tar.gz-Datei at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Entpacken Sie diemsdanalyzer Ordner 15 und legen Sie sie in einem Ordner, auf die Matlab Pfad gehört (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Starten Sie Matlab und initiieren den Analysator durch Eingabe von: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) wo um und s sind die physikalischen Raum und Zeiteinheiten in dem Video. <ol><li> Importieren Sie die Teilchenbahnen durch Eingabe von: [Titel, md] = importTrackMateTracks (&#39;filename.xml&#39;, &#39;clipZ&#39;; &quot;SCALET &#39;) ma = ma.addAll (Tracks); wo &#39;clipZ&#39; entfernt die z-Dimension für ein 2D-Video und &#39;SCALET&#39;. </li><li> Zeichnen Sie die Trajektorien auf Graphen mit: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Berechnen Sie die MSE der Partikel mit: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Zeichnen Sie die Muskel- und Skeletterkrankungen jedes Teilchens: Abbildung ma.plotMSD </li><li> Kombinieren Teilchenbahnen von anderen Videos der gleichen categery (zB Partikel im Wildtyp-Mikrokolonien am Tag 3 embedded) durch Wiederholen 3.5.1.1 bis 3.5.1.4). </li><li> Zeichnen Sie die Ensemblemittel oder die Mittel über alle Kurven: ma.plotMeanMSD Ändern Sie den y- und x-Achse von linear zu logarithmisch. Bei langen Verzögerungszeiten, die MSD-Kurven werden durch unzureichende Statistiken auf längeren Zeitskalen laut. Die MSD-Kurven können auch stark ansteigen aufgrund dynamischer Fehler. Diese Bereiche der Kurve kann mit dem Pinsel-Werkzeug entfernt werdenum das Ende der Kurve auswählen und Auswahl von &#39;Bürsten&#39;&gt; &#39;entfernen Unbrushed&#39; im Menü Extras. </li></ol></li><li> Laden Sie Ezyfit bei <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> und fügen Ezyfit in einen Ordner mit dem Matlab Pfad gehören (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Installieren Sie die Ezyfit Menü, indem Sie in MATLAB-Workspace efmenu installieren. Starten Sie MATLAB mit Ezyfit Menü in der Abbildung Fenster. Montieren Sie die MSD-Kurven mit dem Potenzgesetz, indem Sie in der Ezyfit Menü &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; waren n ist der geschätzte diffusive Exponenten α. HINWEIS: msdanalyzer bedarf der Curve Fitting Toolbox in Matlab für die Montage der MSD-Kurven. Ezyfit ist eine Alternative und kostenlose Software, die Kurvenanpassung durchführen. </li><li> Klar aktuellen Partikelbahnen und Muskel- und Skeletterkrankungen, neue Partikel Muskel- und Skeletterkrankungen an anderen Standorten oder Zeit zu berechnen: klar </li&gt; <li> Nach der Berechnung der verschiedenen mittleren MSD Kurven von Partikeln im Medium (Kontrolle) und Mikrokolonien und undifferenzierte Bereichen verschiedener Stämme, kopieren und fügen Sie die Kurven in einem Diagramm zum Vergleich. Probensteifigkeit und Vernetzungs Anstieg mit niedrigeren MSD-Werte. Flache Kurven unteren α und Proben elastischer als steilere Kurven mit höheren α. </li><li> Wählen Sie die Kurve und gehen Sie auf &quot;Extras&quot;, um auf die Daten Statistiken, wie der Median und Bereich zu suchen. Die MSD des Wulstes ist proportional der Kriechnachgiebigkeit J (t) des Materials, in welchem ​​der Wulst nach der Beziehung eingebettet <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> wobei J = Kriechnachgiebigkeit, d = Teilchendurchmesser, k B = Boltzmann-Konstante, T = Temperatur und t = Zeit. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Mikrorheologie ist ein nützliches Instrument für die lokale rheologischen Messungen in heterogenen Systemen, wie mikrobielle Biofilmen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik, so dass der Echtzeit-Überwachung der rheologischen Veränderungen innerhalb der gleichen biologischen Probe über mehrere Zeitpunkte. In diesem Protokoll wurde partikel Tracking Mikrorheologie um Pel und Psl Exopolysaccharid Mutanten in Reihenfolge angewendet, um zu untersuchen, wie sie die Elastizität und die effektive Vernetzung des Biofilmma...

Die meisten Bakterienzellen sind in der Lage, sowohl planktonischen (frei lebende) und oberflächengebundenen (sessile) Modi des Wachstum 1 einzusetzen. In der Oberfläche gebundenen Modus des Wachstums von Bakterienzellen zu sekretieren und umhüllen sich in großen Mengen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), Biofilme bilden. Die EPS besteht hauptsächlich aus Proteinen, Exopolysaccharid, extrazelluläre DNA und ist wichtig, um die Biofilmbildung 2. Sie dient als physikalische Gerüst durch die Bakterien nutzen können, um räumlich unterscheiden und schützt die Bakterien vor schädlichen Umweltbedingungen und Wirtsreaktionen. Verschiedenen Bestandteile EPS haben verschiedene Rollen in der Biofilmbildung 3 und Veränderungen in der Expression von EPS Komponenten drastisch umzuBiofilmStrukturen 4. EPS-Komponenten können auch als Signalmoleküle 5 und neuere Studien hat bestimmte EPS wirkenden Komponenten mit mikrobiellen Zellen gezeigt, ihre Migration und Biofilm diff Führungserentiation 6-8. Forschung an der EPS hat stark erweiterte auf die morphologische Analysen von Biofilmen von Mutanten in einer bestimmten Komponente der EPS 9,10 defekte produziert basiert. Darüber hinaus wird die EPS üblicherweise am Makromaßstab (bulk Charakterisierung) 11 gekennzeichnet. Morphologische Analyse kann jedoch quantitative Detail und Groß Charakterisierung, die Durchschnittswerte zurückkehrt, verliert den Details, die in der Heterogenität des Biofilms besteht fehlt. Es gibt nun eine steigende Tendenz auf Echtzeit-Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von EPS im Mikromaßstab fortschreiten. Dieses Protokoll zeigt, wie partikel Tracking Mikrorheologie Lage ist, die Raumzeit-Wirkungen von Matrixkomponenten Pel und Psl Exopolysaccharide an die Viskoelastizität und eine effektive Vernetzung von Pseudomonas aeruginosa Biofilm 4 bestimmen. Passive Mikrorheologie ist eine einfache und kostengünstige rheology Methode, die den höchsten Durchsatz räumlicher microrheological Abtastung eines Materials Datum 12,13 bildet. In passiven Mikrorheologie werden Sonden Kugeln in der Probe platziert und deren Brownsche Bewegung, die durch thermische Energie (k B T) angetrieben wird durch Videomikroskopie verfolgt. Mehrere Teilchen gleichzeitig verfolgt werden, und die zeitabhängigen Koordinaten der Partikel folgen einer herkömmlichen Zufallsbewegung. Im Mittel also, bleiben die Teilchen an der gleichen Position. Ist die Standardabweichung der Verschiebungen oder der mittlere quadratische Verschiebung jedoch (MSD) der Partikel, nicht Null ist. Seit viskosen Flüssigkeiten fließen, die Partikel MSD in einem viskosen Fluid wächst linear fortschreitender Zeit. Im Gegensatz dazu ist das polymere Vernetzung in viskoelastischen gefunden oder elastische Stoffe helfen ihnen, Strömung zu widerstehen, und Partikel werden in ihrer begrenzten Verschiebung, was zu Hochebenen in der MSD-Kurve (Abbildung 1A). Diese Beobachtung folgt die Beziehung MSDαt <sbis&gt; α, wobei α die diffusive Exponenten zusammenhängt Verhältnis der elastischen und viskosen Beitrag der Substanz. Für Teilchen, die sich in viskosen Fluiden α = 1, viskoelastischen Stoffen 0 &lt;α &lt;1 ist, und in elastischen Stoffen α = 0. Der MSD können auch verwendet werden, um die Zeitstand, welche die Neigung des Materials zum permanent über verformen berechnen Zeit und schätzt, wie leicht ein Material ausbreitet. Die Grße, Dichte und Oberflächenchemie der Partikel sind für die korrekte Anwendung der microrheological Experiment und sind mit Bezug auf das untersuchte System gewählt (in diesem Fall können die Polymere der Biofilmmatrix siehe 1B). Zunächst misst die Partikel die Rheologie der Substanz mit Strukturen, die viel kleiner als die Teilchen selbst sind. Wenn der Substanz Strukturen sind in ähnlicher Größenordnung an das Teilchen, die Bewegung des parkel wird durch die Form und Ausrichtung der einzelnen Strukturen gestört. Wenn die Strukturen das Teilchen umgebenden viel kleiner sind, jedoch ist dieser Effekt klein und ausgemittelt werden, präsentiert eine homogene Umgebung an das Teilchen (1B). Zweitens sollte die Dichte der Teilchen ähnlich wie das Medium (1,05 g ml -1 für wässrige Medien) sein, dass die Sedimentation vermieden wird, und die Trägheitskräfte vernachlässigbar sind. Die meisten Partikel mit Polystyrol-Gittern die genannten Kriterien erfüllen. Idealerweise hat das Teilchen nicht mit den Polymeren der Biofilmmatrix interagieren, wie die rheologischen Auslegung des Partikel MSD ist nur gültig, wenn eine Bewegung zufällig ist, durch thermische Energie und eine Kollision mit Substanz Strukturen angetrieben. Dies kann durch Prüfen, ob die Sonde Teilchen dazu neigt, zu binden oder abprallen die Oberfläche eines vorge gewachsenen Biofilm beobachtet werden. Trotz des Fehlens von Anziehung zu dem Biofilm, müssen die Partikel in der Lage, in die Matrix eingebaut werden kann.Darüber hinaus kann die physikochemischen Heterogenität des Biofilms in verschiedenen Teilchen mehr als Sonden in den verschiedenen Regionen des Biofilms geeignetes führen. Daher sollte von Partikeln unterschiedlicher Größe und Oberflächenchemie zum Biofilm angewendet werden. Als solches ist die Partikel MSD in der Lage, nützliche Informationen über die verschiedenen Komponenten beitragen, die Rheologie und die Ausbreitung des Biofilms ist. Weiterhin ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Sonden, um eine Information über die räumliche physikochemischen Heterogenität des Biofilms abzuleiten. Dieses Verfahren auf gemischter Arten Biofilmen verwendet werden, um die Wirkung antimikrobiellen Behandlung auf die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu testen, oder aufgebracht zu untersuchen, wie sich die mechanischen Eigenschaften des Biofilms werden aus der Einführung einer anderen Spezies verändert. Partikel MSD können auch nützlich für die Charakterisierung von Biofilm dispersal. Solche Studien wäre hilfreich, in unserem Verständnis von Biofilmen, die möglicherweise verbessern Biofilm-Behandlungen einnd Engineering von Biofilmen für nützliche Tätigkeiten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Die lokalen viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms in verschiedenen Regionen des Biofilms, der die Hohlräume (mittel über dem Biofilm), Ebenen (undifferenzierte flachen Schicht von Zellen) und Mikrokolonien (siehe Etiketten in 2A) aufgenommen wurden untersucht. Die zeitlichen Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms während der Reifung von den Tagen 3 bis 5 wurden ebenfalls bestimmt. Der MSD der Partikel in den Hohlräumen wurde als Kontrolle und vergleichbar mit dem MSD von P...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K Aufrufe.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Serie: In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Forschung

Biotechnik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für<em&gt; In situ</em&gt; 3D-Mapping der bakteriellen Biofilm Physikalische Eigenschaften

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Untersuchung der dreidimensionalen Strömungstrennung, die durch ein Modell Vocal Fold Polyp induziert wird

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...