Wir danken Craig Paul an der Microarray Core Facility für seine Hilfe. Diese Arbeit wurde vom NIH / NCI gewähren # CA118591 aus dem IMAT Programm unterstützt. SLD erkennt auch der Pennsylvania Raum Stipendium Consortium Fellowship für finanzielle Unterstützung. Diese Veröffentlichung wurde auch von der Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabrication Network und der National Science Foundation Cooperative Agreement Nr. 0335765, National Nanotechnology Infrastructure Network, mit der Cornell University unterstützt.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Aptamere sind hoch strukturierte Oligonukleotiden (DNA oder RNA), die Ziele mit vergleichbaren Affinitäten Antikörper 1 binden kann. Sie sind durch ein in-vitro-Selektion Prozess namens Systematische Evolution von Liganden durch EXponentielle Anreicherung (SELEX) für eine Vielzahl von Zielen zu erkennen, von kleinen Molekülen an Proteine ​​und andere Makromoleküle 2-4 identifiziert. Aptamere haben Eigenschaften, die auch für in vivo diagnostische und / oder therapeutische Anwendungen geeignet sind: Neben einer guten Spezifität und Affinität, sie leicht synthetisiert werden, überleben strengere Verarbeitungsbedingungen, sie sind schwach immunogen und ihrer relativ geringen Größe können in einfache Penetration des Ergebnisses Gewebe. Aptamere, die über die Standard-SELEX-Prozess identifiziert werden üblicherweise ~ 80 Nukleotiden (nt), da sie typischerweise von Nukleinsäure-Bibliotheken mit ~ 40 nt langen randomisierten Regionen plus feste Grundierung Websites von ~ 20 nt auf jeder Seite ausgewählt werden. Die feste Primersequenzen können somit fast umfassen ca. 50% der Bibliothek Sequenzen, und deshalb kann positiv oder negativ beeinträchtigen Identifizierung von Aptameren in der Auswahl 3, obwohl schlagen Bioinformatik Ansätze, die den festen Sequenzen nicht wesentlich dazu beitragen, Aptamer-Struktur nach Auswahl 5 . Um diese möglichen Probleme haben Primersequenzen von komplementären Oligonukleotiden blockiert oder ausgeschaltet, um unterschiedliche Sequenzen auf halbem Weg in die Runde der SELEX 6, oder sie haben auf 6-9 nt 7, 8 getrimmt. Wen und Gray 9 ausgebildet einem Primer-freie genomische SELEX-Verfahren, in denen die Primersequenzen waren völlig aus der Bibliothek vor der Auswahl entfernt und wurden dann regeneriert werden, um Verstärkung des ausgewählten genomischen Fragmenten zu ermöglichen. Doch die Technik zu beschäftigen, hat eine einzigartige Genbank konstruiert werden, bei dem sich nur die Vielfalt und die Regeneration nach dem Runden der Selektion beruht auf einer linearen Reamplifikation Schritt. Alternativ sind auch Bemühungen um die Probleme, die durch feste Primersequenzen mit hohem Wirkungsgrad Partitionierung verursacht umgehen mit Problemen in Bezug auf die PCR-Amplifikation 10 erfüllt. Wir haben ein Primer-free (PF) Auswahl-Verfahren deutlich vereinfacht SELEX Verfahren und beseitigt effektiv Primer-Störungsprobleme 11, 12 entwickelt. Die Protokolle der Arbeit in einer einfachen Weise. Die zentrale random Region der Bibliothek ist ohne fremde flankierenden Sequenzen gereinigt und ist ein geeignetes Ziel (zum Beispiel, um ein gereinigtes Protein oder komplexen Gemischen wie Zell-Linien) gebunden. Dann werden die gebundenen Sequenzen erhalten werden, wieder mit flankierenden Sequenzen, und wieder verstärkt auf ausgewählte Sub-Bibliotheken zu generieren. Als ein Beispiel, hier sind wir selektierten Aptamere zu S100B, ein Protein Marker für Melanome. Binding Assays zeigte Kd s in den 10 -7 - 10 -8 M Reihe nach ein paar Runden der Selektion, und wir zeigen, dass die Aptamere effektiv funktionieren in einer Sandwich-Bindung Format.

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

SELEX-Protokolle umfassen mehrere Runden der Selektion, von denen jeder Regeneration von Liganden, die wiederum erfordern feste Primersequenzen flankierenden die zufällige Bibliothek Regionen erfordern. Diese festen Primersequenzen können mit der Auswahl (false positive und negative) stören. Hier präsentieren wir eine Grundierung-free-Protokoll.

Primer-Free Aptamer Selection mit einem zufälligen DNA-Bibliothek

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

primer-free-aptamer-selection-using-a-random-dna-library

Research

JoVE Journal

Biology

24.6K Aufrufe.  Pennsylvania State University. SELEX-Protokolle umfassen mehrere Runden der Selektion, von denen jeder Regeneration von Liganden, die wiederum erfordern feste Primersequenzen flankierenden die zufällige Bibliothek Regionen erfordern. Diese festen Primersequenzen können mit der Auswahl (false positive und negative) stören. Hier präsentieren wir eine Grundierung-free-Protokoll.