Diese Arbeit wurde von 115.347-RSG-08-271 bis 01-GMC von ACS, und durch CA138631 Zuschuss von NIH unterstützt.

Das Protokoll wurde ursprünglich von B. Ren, 2001 angepasst. Es stellt eine leichte Modifikation des Protokolls durch Odom et al. 5, die Sie hier finden <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-Block und Bindung des Antikörpers an magnetische Kügelchen (Sollte der Nacht vor dem nächsten Schritt ausgeführt werden) <ol><li> Wash 100 L Dynabeads Protein G (pro IP, für mehrere IPs kombinieren) in 1 ml frischem BSA / PBS-Lösung (50 mg BSA in 10 mL PBS-Diese Lösung wird für eine Woche reicht). </li><li> Sammeln Sie die Kugeln mit einem Magnetfuß, und wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male. </li><li> Anschließend fügen Sie 10 ug von Antikörpern gegen 250 ul der Perlen Gülle in PBS / BSA-Lösung (pro IP) beimpft und über Nacht auf einer rotierenden Plattform bei 4 ° C. </li><li> Nach der Fertigstellung, waschen Sie die Beads dreimal in 1 ml der PBS / BSA-Lösung und dann in 10 ul PBS / BSA-Lösung (pro IP) resuspendieren. </li></ol> 2. Zell-Vernetzung <ol><li> Zu Beginn dieses Verfahrens, wachsen etwa 10 8 Zellen pro Immunpräzipitation oder IP. Hier sind diffuse histiozytisches Lymphom U937-Zellen verwendet und induzierte für monozytären Differenzierung mit TPA für 96 Stunden. </li><li> Nach Zellwachstum, fügen Formaldehyd-Lösung direkt auf die Medien bis zu einer Endkonzentration von 1%. Dann können wirbeln die Flaschen kurz und sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten sitzen. Dann saugen die Medien und waschen Sie die Zellen mit 15 ml eiskaltem PBS. Wiederholen Sie diesen waschen einmal. </li><li> Als Nächstes fügen Sie 6 ml Lysispuffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100, mit Protease-Inhibitoren) in jede der Kolben auf Eis. Dann rocken die Kolben für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Schließlich Ernte der Zellen mit einem Zellschaber und übertragen diese auf 15 ml konische Röhrchen. An dieser Stelle können die Zellen bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> 3. Zell-Beschallung <ol><li> Wenn die Zellen wurden eingefroren, tauen sie aus. Einmal aufgetaut, drehen Sie das Zellen nach unten bei 3.000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Dann die Zellen in 6 ml Lysepuffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, mit Protease-Inhibitoren). Rock the Röhrchen vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspendieren der Zellen in 2,5 ml Lysispuffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin, mit Protease-Inhibitoren) . </li><li> Als nächstes bereiten die Aussetzung für Beschallung, indem Sie es in ein Becherglas mit Eiswasser mit der Mikrospitze eines Branson 450 Sonifier auf einen Wert zwischen 50 und 60% Amplitude. </li><li> Mit Ultraschall die Lösung für eine 30 Sekunden konstant platzen und kühlen auf Eis für 1 Minute. Wiederholen Sie diese Impulse von 10 bis 15 mal. Dann Pipette der Inhalt des Röhrchens auf und ab und übertragen Sie sie auf eine neue Röhre. Weiter zu Puls und die Lösung eine zusätzliche 5-mal. </li><li> Nach Beschallung, mit 10% Triton X-100 bis 1 / 10 der Lösung Volumen. Übertragen Sie die Lysate bis 1,5 mL Zentrifugenröhrchen, und drehen Sie die Trümmer in einer Mikrozentrifuge. Übertragen Sie anschließend das Zelllysat in ein neues Röhrchen. </li></ol> 4. Chromatin Immunopräzipitation <ol><li> Vor Chromatinimmunpräzipitation oder Chip, sparen Sie 50 ul der Zelllysate wie das Eingangs-Sample. Dann verbinden die gelöscht Zelllysat mit Dynabeads, um Antikörper, die zuvor wie oben beschrieben hergestellt pre-gebunden. Rock the Mischung, zusätzlich zu den 50 ul Eingang Probe bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Kugeln mit 1 mL der Waschpuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, 0,7% Natriumdeoxycholat, 1% NP-40). Verwenden Sie dann ein magnetisches stehen, um die Perlen zu sammeln und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen waschen 6 bis 8 mal. </li><li> Führen Sie eine letzte Waschung mit 1 mL TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Drehen Sie die Perlen in einer Mikrozentrifuge bei 3.000 rpm für 2 Minuten bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation absaugen restliche TE-Puffer. </li><li> Dann fügen Sie 100 ul Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) zu den Proben. Unmittelbar nach, inkubieren Sie die Proben bei 65 ° C für 10 bis 15 Minuten. Scratch die Rohre gegen eine 1,5-ml-Tube-Rack alle 2 Minuten, um die Perlen in der Schwebe zu halten. </li><li> Sammeln Sie die Kugeln mittels Zentrifugation und die magnetische stehen, und überweisen Sie den Überstand in ein PCR-Röhrchen. Dann rufen Sie die zuvor gespeicherten Eingangs-Sample, und fügen Sie 3 Bände der Elutionspuffer. </li><li> Schließlich legen Sie die IP-und Input-Proben in den Thermocycler über Nacht bei 65 ° C bisUmkehr der Querverbindungen. </li><li> Am folgenden Tag, fügen Sie 1 Volumen TE-Puffer zu den Proben. Dann fügen RNase A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 ug / ul. Inkubieren Sie die Proben in den Thermocycler für 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation, fügen Proteinase K in einer Endkonzentration von 0,2 ug / ul. Dann inkubieren Proben im Thermocycler bei 55 ° C für 2 Stunden. </li><li> Anschließend entpacken Sie die Proben einmal mit einem Volumen Phenol. Entpacken Sie die Proben ein zweites Mal mit einem Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol. Schließlich, extrahieren Sie die Proben noch einmal mit einem Volumen Chloroform: Isoamylalkohol. </li><li> Dann fügen Sie 30 g Glykogen zu jeder Probe. Fügen Sie außerdem NaCl auf eine Endkonzentration von 0,2 Molar und zwei Volumina Ethanol zu den Proben. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei -80 ° C. Nach der Inkubation, Spin der Proben und Dekantieren des Überstandes. Waschen Sie die Pellets mit 500 ul 75% Ethanol. Dann trocknen die Pellets und resuspendieren Sie in 40 ul Wasser. </li><li> So überprüfen Sie die Größen der DNA-Fragmente durch die Beschallung Verfahren hergestellt, Last 5 ug des gereinigten Eingang Probe in einem 1,8% Agarosegel und führen Sie das Gel. Die Beschallung Verfahren sollte Fragmente im Bereich von 150-350 Basenpaaren zu produzieren. Allerdings, wenn die Fragmente nicht in diesem Bereich fallen, sollte die Beschallung Verfahren durch Variation der Anzahl von Bursts und die Amplitude eingestellt werden. </li><li> Um Robustheit und Spezifität der ChIP überprüfen, die Anreicherung unter Kontrolle bindenden Regionen, indem Gen-spezifischen PCR mit 1 ul der IP-Proben und eine Verdünnungsreihe des Eingangs Probe. Zwei bis drei &quot;gebunden&quot; Regionen und ein ungebundenes Steuerelement Region müssen gewählt, um die Qualität von IP-und Input-Proben zu testen. </li></ol> 5. Amplifikation von genomischer DNA <ol><li> Beginnend mit 34 ul der IP Probe oder 200 ng des Eingangs Probe durchführen Ende zu reparieren, &#39;A&#39; tail hinaus und Ligation von Adaptern, um DNA-Fragmente unter Verwendung von genomischer DNA Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purify die DNA mit einem MinElute PCR Purification Kit und dann eluieren es in Puffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5), die wurde auf 50 ° C vorgewärmten Zum Beispiel, Beanspruchungsklasse 23 ul und 46 ul für die endgültige Elution von IP-und Input-DNA Proben. </li><li> Nehmen Sie die PCR-Reaktion unter Verwendung von 23 ul der DNA mit Adaptern und 25 ul Phusion DNA-Polymerase aus dem Kit, 1 ul 20 uM Sol_PCR_1 und 1 ul 20 uM Sol_PCR_2. Führen Sie die PCR-Reaktion wie folgt: 1) 30 Sekunden bei 98 ° C; 2) 10 Sekunden bei 98 ° C; 3) 30 Sekunden bei 65 ° C; 4) 30 Sekunden bei 72 ° C; Wiederholung der Schritte Schritt 2-4 18 mal und dann 5 Minuten bei 72 ° C, schließlich halten bei 4 ° C. </li><li> Nach PCR-Amplifikation, reinigen die DNA mit dem QIAGEN MinElute PCR Purification Kit. Pre-warme 15 ul Puffer EB auf 50 ° C und eluieren DNA. Verdünnen 0,5 ul der Probe 1:4 und führen Sie eine Nanodrop Lesen. </li></ol> 6. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte <ol><li> Zur Reinigung der amplifizierten Produkte, bereiten ein 1,8% Agarosegel von 50 mL mittels HPLC-grade Wasser. Add TAE und Ethidiumbromid nach dem Agarose geschmolzen ist. Dann gießen Sie das Gel. Legen Sie das Gel nach Zugabe von 4 ul Ladepuffer auf die Eingangs-und IP-Proben. Führen Sie dann das Gel bei 120 Volt für 45 Minuten. </li><li> Analysieren Sie das Gel nach der Ausführung. Das Gel sollte, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren hergestellt offenbaren. Sie stellen genomische DNA-Fragmente zwischen 50 und 250 Basenpaare lang und einen Adapter. </li><li> Excise der Region Gel mit dem Material in dem 150 350-Basenpaar-Bereich mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um zu vermeiden Auslösen der Adapter-Adapter Band läuft, die bei etwa 120 Basenpaare. Stellen Sie die DNA mit Hilfe eines QIAquick Gel Extraction Kit Anweisungen des Herstellers. Insbesondere verwenden Sie eine Spalte aus dem QIAquick Gel Extraction Kit für ein Gel Stück 400 mg oder weniger. Zu Beginn der Extraktion, fügen Sie 3 Bände von QG Puffer 1 Volumen Gel. Add 1 Volumen Isopropanol und laden Sie die Mischung auf die Säule. Verwenden Sie 0,5 ml QG auf die Säule zu waschen, gefolgt von Standard-Verfahren in Kit beschrieben. Verwenden Sie H 2 O vorgewärmt auf 50 ° C, um die DNA zu eluieren. Inkubieren Sie die Spalte mit 30 ul H 2 O für 5 Minuten bei 37 ° C vor dem Spinnen es nach unten. </li><li> Trocknen Sie die Probe auf genau 11 ul in einem Speedvac ohne Wärme. Nehmen Sie 1 ul der Probe und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nanodrop Spektralphotometer. </li><li> Schließlich identifizieren bereichert Genprodukte mit dem Illumina Genome AnalyzerIIe, wie dies unter <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Das übergeordnete Ziel der folgenden Experiments ist es, genomische Ziele KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren. (P1) Dies ist bei der Vorbereitung der vernetzten Chromatin, beschallt, um DNA-Fragmente geeigneter Größe zu produzieren erreicht ist. (P2) In einem zweiten Schritt werden RBP2 gebundenen DNA-Fragmente mit RBP2 Antikörper immunpräzipitiert. (P3) Als nächstes werden die wiederhergestellten DNA-Fragmente an den Enden repariert und Adapter sind an den Enden der genomischen DNA ligiert, um Bibliotheken von genomischer DNA für die Analyse vorzubereiten auf die Strömung Zellen in der Illumina Cluster Station. Die DNA-Bibliotheken sind durch PCR mit geringen Anzahl von Zyklen amplifiziert. (P4) Schließlich liest Illumina sequenziert kurz sind eindeutig auf das menschliche Genom ausgerichtet ist, sind signifikante Peaks identifiziert und mit Anmerkungen versehen, um die nächste Gene, um RBP2 bereichert Regionen zu identifizieren. (P5) Ergebnisse erzielt, die zeigen, molekularen Funktionen mit RBP2 Zielgene auf genomweite Identifizierung RBP2 bereichert Regionen basieren verbunden. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Überprüfung der Ergebnisse von Chromatin Beschallung Um die Größe der DNA-Fragmente durch die Beschallung Verfahren hergestellt zu überprüfen, wurde 5 ug (10.1) des gereinigten Eingang Probe auf 1,8% Agarosegel aufgetragen. Wie erwartet, produziert unser Beschallung Verfahren Fragmente im Bereich von 150-350 bp. Allerdings, wenn die Fragmente nicht in diesem Bereich fallen, sollte die Beschallung Verfahren entsprechend angepasst werden, indem die Anzahl der Bursts und die Amplitude. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte. Die PCR-Produkte werden auf einem Gel laufen, um den Adapter zu entfernen und wählen Sie eine Größe-Reihe von Vorlagen für die Cluster-Generation-Plattform. Dieses Gel zeigt, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren hergestellt wurden. Sie stellen genomische DNA-Fragmente zwischen 50 und 250 Basenpaare lang und einen Adapter. Wir Verbrauchsteuern der ausgewählten Region des Gels mit einem Skalpell. Es sollte darauf geachtet, um den Adapter-Adapter Band, die bei etwa 120 Basenpaare führt zu vermeiden. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Isoform-spezifischen Antikörper ermöglicht die Unterscheidung zwischen großen und kleinen Isoformen RBP2. RBP2 Proteinstruktur in Domain-Ansicht präsentiert. RBP2 enthält mehrere Domänen: die katalytische Histon-Demethylierung JmjC Domain und die damit verbundenen JmjN Domäne, einer trockenen Domain-fähig Sequenz-spezifische DNA-Bindung, eine C5HC2 Zinkfinger, die möglicherweise mit DNA oder anderen Proteinen, und mehrere PHD-Domänen interagieren können. Die beiden anti-RBP2 Antikörper, die zwischen RBP2 Isoformen unterscheiden können gegen die RBP2 Fragmente, die durch dicke Linien angedeutet abgeleitet. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Abbildung 5a" /> Abbildung 5a. Übersicht der RBP2 bindenden Regionen zusammen mit Chromosom und Ensembl Gene. Genomic Koordinaten identifiziert bereichert RBP2 (alle Isoformen und große Isoform) bindenden Regionen vorgestellt Chromosom weise. Occupances von Ensembl Gene (Version 54; HG18) in den Chromosomen (Chromosom 10 in diesem Bild) sind als schwarze Balken (oben) präsentiert. Jeder RBP2 bindende Region ist als eine vertikale Linie, wo das mittlere Fenster zeigt alle RBP2 Isoformen bindenden Regionen auf Chromosom 10 vertreten, und auf der Unterseite zeigt RBP2 große Isoform bindenden Regionen. Die mittleren und unteren Platten geben Überblick über die Überschneidungen und spezifische Belegung RBP2 Isoformen auf Chromosom 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Abbildung 5b" /> Abbildung 5b. Functional Bereicherung Analyse RBP2 Zielgene. Heatmap zeigt FDR korrigiert signifikant (p-Wert ≤ 0,05) angereichert GO Molecular Function Kategorien unter den Genen gebunden (am nächsten Gene an die RBP2 bindende Region) durch RBP2 (alle Großen und Ganzen Isoformen). Farben nach Rot zeigen eine hohe statistische Signifikanz zeigt gelb geringe statistische Signifikanz und Grau gibt keine statistische Signifikanz. Enrichment-Analyse zeigt die Überlappung und Isoform spezifischen molekularen Funktionen der RBP2 Zielgene.

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	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

Funktionelle Unterschiede zwischen RBP2 Isoformen sind nicht bestimmt worden. Wir haben ein umfassendes Konzept zur genomischen Regionen von RBP2 Isoformen gebunden Ermittlung und Festlegung der funktionalen Kategorien, die diese Regionen darstellen. Dies wurde durch ChIP-Seq Analyse durch bioinformatische Analyse der erhaltenen Sequenz liest, erreicht. RBP2 modifiziert methylierte Lysinreste auf Histone. Wir fanden, dass RBP2 große Isoform die Anerkennung Modul enthält für methylierte Histon-Lysin und RBP2 kleinen Isoform fehlt diesem Modul binden an verschiedene Regionen im menschlichen Genom (Abbildung 5A). Wichtig ist, dass Isoform-spezifischen Regionen und überlappenden Regionen von Genen gehören mit unterschiedlichen molekularen Funktionen (Abbildung 5B). Zum Beispiel, &quot;Chromatin Bindung&quot; und &quot;Transkriptionsfaktorbindungsstellen&quot; Funktionen können auf Gen-Targets von RBP2 kleinen Isoform zugeschrieben werden, aber nicht von RBP2 großen Isoform (Abbildung 5B). Durch den Vergleich der tatsächlichen Gen-Sets generiert für alle Isoformen und RBP2 großen Isoform (Daten nicht gezeigt), können wir auch festlegen, ob die große Isoform ist spezifisch an bestimmte Gene rekrutiert.

Oligonukleotidsequenzen 2006 Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. <ul><li> Sol_PCR_1 Sequenz 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sequenz 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Rekrutierung von Transkriptions-und epigenetische Faktoren, um ihre Ziele ist ein wichtiger Schritt in ihrer Regulierung. Prominent in Rekrutierung featured sind die Protein-Domänen, die auf bestimmte Histon-Modifikationen zu binden. Ein solcher Bereich ist die Anlage homeodomain (PHD), in mehreren Chromatin-bindenden Proteinen gefunden. Die epigenetische Faktor RBP2 mehrere PHD-Domänen, jedoch haben sie unterschiedliche Funktionen (Abbildung 4). Insbesondere bindet die C-terminale Domäne PHD, in einem RBP2 onkogenen Fusion in menschlichen Leukämien gefunden, um trimethyliertes Lysin 4 in Histon H3 (H3K4me3) 1. Das Transkript entsprechend der RBP2 Isoform mit dem C-terminalen PHD sammelt während der Differenzierung von promonocytic, Lymphom-derived, U937-Zellen in Monozyten 2. In Übereinstimmung mit beiden Datensätzen zeigte genomweite Analyse, dass in differenzierten U937-Zellen, die RBP2 Protein genomischen Regionen in hohem Grade für H3K4me3 3 angereichert wird lokalisiert. Lokalisierung von RBP2 seine Ziele korreliert mit einer Abnahme der H3K4me3 aufgrund RBP2 Histon-Demethylase-Aktivität und eine Abnahme der transkriptionellen Aktivität. Im Gegensatz dazu sind zwei weitere PHDs von RBP2 nicht H3K4me3 binden. Bemerkenswert ist, dass die C-terminale Domäne von PHD RBP2 in den kleineren RBP2 Isoform 4 fehlen. Es ist denkbar, dass die kleinen Isoform RBP2, die Interaktion fehlt mit H3K4me3, von der größeren Isoform in der genomischen Lage unterscheidet. Der Unterschied in der genomischen Lage des RBP2 Isoformen für die beobachtete Vielfalt in RBP2 Funktion Konto. Insbesondere ist RBP2 eine kritische Spieler in der zellulären Differenzierung durch die Retinoblastomprotein (pRB) vermittelt. In Übereinstimmung mit diesen Daten, frühere genomweite Analyse, ohne Unterscheidung zwischen Isoformen, wurden zwei unterschiedliche Gruppen von RBP2 Zielgene: 1) Gene durch RBP2 in einer Weise, die unabhängig von Differenzierung gebunden ist; 2) Gene durch RBP2 in einer gebundenen Differenzierung- abhängigen Weise. Zur Identifizierung Unterschiede in der Lokalisation zwischen den Isoformen führten wir genomweite Standortanalyse durch ChIP-Seq. Mit Antikörpern, die sowohl RBP2 Isoformen wir alle RBP2 Ziele gefunden haben zu erkennen. Zusätzlich haben wir Antikörper, binden nur groß und nicht klein RBP2 Isoform (Abbildung 4). Nach der Identifizierung der große Isoform Ziele kann man dann davon subtrahieren alle RBP2 Ziele, um die Ziele von kleinen Isoform offenbaren. Diese Daten zeigen, den Beitrag der Chromatin-Interaktion Domain in Protein Einstellung in ihren Bindungsstellen im Genom.

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Aufrufe.  University of Illinois Chicago - UIC. Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Serie: Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Genomweite Analyse der Aminoacylierung (Charging) Ebenen der tRNA mittels Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).