Wir danken den anderen Mitgliedern des Javierre-Labors für ihr Feedback zum Manuskript. Wir danken dem CERCA-Programm, der Generalitat de Catalunya und der Josep-Carreras-Stiftung für die institutionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der FEDER/dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (RTI2018-094788-A-I00), der European Hematology Association (4823998) und der Spanish Association against Cancer (AECC) LABAE21981JAVI finanziert. BMJ wird durch das Junior Leader-Projekt der La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001) finanziert, LR wird durch ein AGAUR FI-Stipendium (2019FI-B00017) und LT-D durch ein FPI-Stipendium (PRE2019-088005) finanziert. Wir danken dem Doktorandenprogramm Biochemie und Molekularbiologie der Universitat Autònoma de Barcelona für seine Unterstützung. Keiner der Geldgeber war zu irgendeinem Zeitpunkt an der Versuchsplanung oder dem Schreiben des Manuskripts beteiligt.

Ein umfassender Ansatz zur Untersuchung des Promotor-Interaktoms in seltenen Zellen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

liCHi-C bietet die Möglichkeit, hochauflösende Promotor-Interaktom-Bibliotheken zu generieren, indem ein ähnlicher experimenteller Rahmen wie PCHi-Cs verwendet wird, jedoch mit einer stark reduzierten Zellzahl. Dies wird in hohem Maße durch den Wegfall unnötiger Schritte wie Phenolreinigung und Biotinentfernung erreicht. Beim klassischen Hi-C-Protokoll57 für die Ligatur im Zellkern und seiner nachfolgenden Derivatetechnik PCHi-C wird Biotin aus nicht-ligierten Restriktionsfragmenten entfernt...

Die zeitliche Genexpression treibt die Zelldifferenzierung und letztendlich die Entwicklung von Organismen voran, und ihre Veränderung steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten 1,2,3,4,5. Die Gentranskription wird durch die Wirkung von regulatorischen Elementen fein reguliert, die als proximal (d. h. Genpromotoren) und distale (z. B. Enhancer oder Silencer) klassifiziert werden können, von denen letztere häufig weit von ihren Zielgenen entfernt sind und physisch mit ihnen durch Chromatinschleifen interagieren, um die Genexpression zu modulieren 6,7,8.
Die Identifizierung distaler regulatorischer Regionen im Genom ist eine Angelegenheit, über die man sich weitgehend einig ist, da diese Regionen spezifische Histonmodifikationenaufweisen 9,10,11 und spezifische Transkriptionsfaktor-Erkennungsmotive enthalten, die als Rekrutierungsplattformen für sie fungieren12,13,14. Außerdem haben sie im Fall von Enhancern und Super-Enhancern 15,16 auch eine geringe Nukleosomenbelegung 17,18 und werden in nicht-kodierende eRNAs transkribiert 19,20.
Nichtsdestotrotz sind die Zielgene der einzelnen distalen regulatorischen Elemente schwieriger vorherzusagen. In den meisten Fällen sind Interaktionen zwischen distalen regulatorischen Elementen und ihren Zielen zelltyp- und stimulusspezifisch 21,22, erstrecken sich über Hunderte von Kilobasen, überbrücken andere Gene in jede Richtung 23,24,25 und können sogar innerhalb von intronischen Regionen ihres Zielgens oder anderer nicht dazwischenliegender Gene lokalisiert werden 26,27. Darüber hinaus können distale regulatorische Elemente auch mehr als ein Gen gleichzeitig steuern und umgekehrt28,29. Diese Positionskomplexität erschwert es, regulatorische Zusammenhänge zwischen ihnen zu lokalisieren, und daher bleiben die meisten Ziele der einzelnen regulatorischen Elemente in jedem Zelltyp unbekannt.
In den letzten Jahren gab es einen bedeutenden Boom bei der Entwicklung von Techniken zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) zur Untersuchung von Chromatin-Interaktionen. Die am weitesten verbreitete von ihnen, Hi-C, ermöglicht es, eine Karte aller Interaktionen zwischen jedem Fragment des Genoms einer Zelle zu erstellen30. Um jedoch signifikante Wechselwirkungen auf der Ebene der Restriktionsfragmente zu erkennen, verlässt sich Hi-C auf eine ultratiefe Sequenzierung, die seine Verwendung zur routinemäßigen Untersuchung der regulatorischen Landschaft einzelner Gene verbietet. Um diese wirtschaftlichen Einschränkungen zu überwinden, haben sich mehrere anreicherungsbasierte 3C-Techniken herausgebildet, wie z. B. ChIA-PET31, HiChIP 32 und sein Gegenstück HiCuT33 mit geringem Input. Diese Techniken beruhen auf der Verwendung von Antikörpern zur Anreicherung für genomweite Interaktionen, die durch ein bestimmtes Protein vermittelt werden. Nichtsdestotrotz ist das Alleinstellungsmerkmal dieser 3C-Techniken auch der Fluch ihrer Anwendung; Anwender verlassen sich auf die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern für das interessierende Protein und können Bedingungen nicht vergleichen, unter denen die Bindung des Proteins dynamisch ist.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ist eine weitere anreicherungsbasierte 3C-Technik, die diese Einschränkungen umgeht34,35. Durch den Einsatz eines biotinylierten RNA-Sondenanreicherungssystems ist PCHi-C in der Lage, genomweite hochauflösende Bibliotheken von Genomregionen zu erstellen, die mit 28.650 humanen oder 27.595 mausannotierten Genpromotoren interagieren, die auch als Promotor-Interaktom bekannt sind. Dieser Ansatz ermöglicht es, signifikante langreichweitige Wechselwirkungen bei der Auflösung von Restriktionsfragmenten sowohl von aktiven als auch von inaktiven Promotoren zu detektieren und Promotor-Interaktome zwischen allen Bedingungen unabhängig von der Dynamik von Histonmodifikationen oder Proteinbindungen robust zu vergleichen. PCHi-C wurde in den letzten Jahren häufig eingesetzt, um Promotor-Interaktom-Reorganisationen während der Zelldifferenzierung zu identifizieren 36,37, den Wirkmechanismus von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren38,39 und neue potenzielle Gene und Signalwege zu entdecken, die bei Krankheiten durch nicht-kodierende Varianten dereguliert werden 40,41,42,43,44,45,46,47,48, daneben neue nicht-kodierende Treibermutationen49,50. Außerdem kann diese Technik durch einfaches Modifizieren des Erfassungssystems entsprechend der biologischen Fragestellung angepasst werden, um jedes Interaktom (z. B. das Enhancer-Interaktom 51 oder das Interaktom einer Sammlung von nicht-kodierenden Veränderungen41, 52) abzufragen.
PCHi-C ist jedoch auf mindestens 20 Millionen Zellen angewiesen, um die Technik durchzuführen, was die Untersuchung knapper Zellpopulationen, wie sie häufig in der Entwicklungsbiologie und in klinischen Anwendungen verwendet werden, verhindert. Aus diesem Grund haben wir Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine neue kostengünstige und anpassbare Methode, die auf dem experimentellen Rahmen von PCHi-C basiert, um hochauflösende Promotor-Interaktome mit geringem Zellinput zu erzeugen. Durch die Durchführung des Experiments mit minimalen Röhrchenänderungen, dem Austausch oder der Eliminierung von Schritten aus dem ursprünglichen PCHi-C-Protokoll, der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Änderung der Reagenzienkonzentrationen wird die Komplexität der Bibliothek maximiert und es ist möglich, qualitativ hochwertige Bibliotheken mit nur 50.000 Zellen zu generieren53.
Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) wurde mit PCHi-C verglichen und verwendet, um die Neuverdrahtung des Promotor-Interaktoms während der Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Zellen aufzuklären, potenzielle neue krankheitsassoziierte Gene und Signalwege zu entdecken, die durch nicht-kodierende Veränderungen dereguliert werden, und Chromosomenanomalien zu erkennen53. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll und die verschiedenen Qualitätskontrollen durch die Technik werden hier bis zur endgültigen Generierung der Bibliotheken und ihrer rechnerischen Analyse detailliert beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td>
			<td>Qiuantabio</td>
			<td>2302820</td>
			<td>For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters and PCR primers for library amplification</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Bought as individual primers with PAGE purification for NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHiCAGO R package</td>
			<td>1.14.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanNGS beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CNGS-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U120A, U121A, U122A, U123A</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65602</td>
			<td>For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiCUP</td>
			<td>0.8.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention filter tips&#160;(10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L and 1000 &#181;L)</td>
			<td>ZeroTip</td>
			<td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>For sonication in section 6 (sonication)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3131M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers for quality controls</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips&#160;and caps</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>410022, 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531L</td>
			<td>For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) 
			and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td>For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutsmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS - Solution 10% for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-4831</td>
			<td>Custom designed mouse or human capture system, used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-8645</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931107</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224025</td>
			<td>For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 2000000/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4200 instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow to study the promoter-centric spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

Die räumlich-zeitliche Gentranskription wird durch distale regulatorische Elemente wie Enhancer und Silencer streng reguliert, die auf die physische Nähe zu ihren Zielgenpromotoren angewiesen sind, um die Transkription zu kontrollieren. Obwohl diese regulatorischen Elemente leicht zu identifizieren sind, sind ihre Zielgene schwer vorherzusagen, da die meisten von ihnen zelltypspezifisch sind und in der linearen Genomsequenz durch Hunderte von Kilobasen getrennt sein können, wodurch andere Nicht-Zielgene übersprungen werden. Seit einigen Jahren ist Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) der Goldstandard für die Assoziation von distalen regulatorischen Elementen mit ihren Zielgenen. PCHi-C ist jedoch auf die Verfügbarkeit von Millionen von Zellen angewiesen, was die Untersuchung seltener Zellpopulationen, wie sie üblicherweise aus primären Geweben gewonnen werden, verbietet. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine kostengünstige und anpassbare Methode zur Identifizierung des Repertoires an distalen regulatorischen Elementen, die jedes Gen des Genoms steuern. liCHi-C basiert auf einem ähnlichen experimentellen und rechnerischen Rahmen wie PCHi-C, aber durch minimale Röhrchenwechsel, Modifikation der Reagenzienkonzentration und -volumina sowie Austausch oder Eliminierung von Schritten wird ein minimaler Materialverlust während des Bibliotheksaufbaus verursacht. Insgesamt ermöglicht liCHi-C die Untersuchung der Genregulation und der raumzeitlichen Genomorganisation im Kontext der Entwicklungsbiologie und der zellulären Funktion.

Temporal gene expression drives cell differentiation and, ultimately, organism development, and its alteration is closely related to a wide plethora of diseases1,2,3,4,5. Gene transcription is finely regulated by the action of regulatory elements, which can be classified as proximal (i.e., gene promoters) and distal (e.g., enhancers or silencers), the latter of which are frequently located afar from their target genes and physically interact with them through chromatin looping to modulate gene expression6,7,8.
The identification of distal regulatory regions in the genome is a matter which is widely agreed upon, since these regions harbor specific histone modifications9,10,11 and contain specific transcription factor recognition motifs, acting as recruiting platforms for them12,13,14. Besides, in the case of enhancers and super-enhancers15,16, they also have low-nucleosome occupancy17,18 and are transcribed into non-coding eRNAs19,20.
Nonetheless, each distal regulatory element&#39;s target genes are more difficult to predict. More often than not, interactions between distal regulatory elements and their targets are cell-type and stimulus specific21,22, span hundreds of kilobases, bridging over other genes in any direction23,24,25, and can even be located inside intronic regions of their target gene or other non-intervening genes26,27. Furthermore, distal regulatory elements can also control more than one gene at the same time, and vice versa28,29. This positional complexity hinders pinpointing regulatory associations between them, and therefore, most of each regulatory element&#39;s targets in every cell type remain unknown.
During recent years, there has been a significant boom in the development of chromosome conformation capture (3C) techniques for studying chromatin interactions. The most widely used of them, Hi-C, allows to generate a map of all the interactions between every fragment of a cell&#39;s genome30. However, to detect significant interactions at the restriction fragment level, Hi-C relies on ultra-deep sequencing, prohibiting its use to routinely study the regulatory landscape of individual genes. To overcome this economic limitation, several enrichment-based 3C techniques have emerged, such as ChIA-PET31, HiChIP32, and its low-input counterpart HiCuT33. These techniques depend on the use of antibodies to enrich for genome-wide interactions mediated by a specific protein. Nonetheless, the unique feature of these 3C techniques is also the bane of their application; users count on the availability of high-quality antibodies for the protein of interest and cannot compare conditions in which the binding of the protein is dynamic.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is another enrichment-based 3C technique that circumvents these limitations34,35. By employing a biotinylated RNA probe enrichment system, PCHi-C is able to generate genome-wide high-resolution libraries of genomic regions interacting with 28,650 human- or 27,595 mouse-annotated gene promoters, also known as the promoter interactome. This approach allows one to detect significant long-range interactions at the restriction fragment level resolution of both active and inactive promoters, and robustly compare promoter interactomes between any condition independently of the dynamics of histone modifications or protein binding. PCHi-C has been widely used over recent years to identify promoter interactome reorganizations during cell differentiation36,37, identify the mechanism of action of transcription factors38,39, and discover new potential genes and pathways deregulated in disease by non-coding variants40,41,42,43,44,45,46,47,48, alongside new driver non-coding mutations49,50. Besides, by just modifying the capture system, this technique can be customized according to the biological question to interrogate any interactome (e.g., the enhancer interactome51 or the interactome of a collection of non-coding alterations41,52).
However, PCHi-C relies on a minimum of 20 million cells to perform the technique, which prevents the study of scarce cell populations such as the ones often used in developmental biology and clinical applications. For this reason, we have developed low input Capture Hi-C (liCHi-C), a new cost-effective and customizable method based on the experimental framework of PCHi-C to generate high-resolution promoter interactomes with low-cell input. By performing the experiment with minimal tube changes, swapping or eliminating steps from the original PCHi-C protocol, drastically reducing reaction volumes, and modifying reagent concentrations, library complexity is maximized and it is possible to generate high-quality libraries with as little as 50,000 cells53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) has been benchmarked against PCHi-C and used to elucidate promoter interactome rewiring during human hematopoietic cell differentiation, discover potential new disease-associated genes and pathways deregulated by non-coding alterations, and detect chromosomal abnormalities53. The step-by-step protocol and the different quality controls through the technique are detailed here until the final generation of the libraries and their computational analysis.

Autor im Rampenlicht: Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der promotorzentrierten räumlich-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen  

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

With liCHi-C, the main question that we are trying to answer is how the chromatin interacts in the nucleus, and therefore, to understand a new layer of gene regulation. We have proven with liCHi-C that we can explore the genome organization of a given sample, link the non-coding mutation associated with disease with potential genes affected, and detect chromosomal rearrangements, such as translocation, for example, in tumor samples. Now we can explore the 3D chromatin organization of scar cell types, such as primary stem cells or relevant clinical samples.Our protocol reduces the input materials and the time and cost needed to obtain quality data to explore the genome organization at the restriction fragment resolution. liCHi-C is expanding the reach of the 3D chromatin organization field, allowing us to explore new cell types previously impossible to analyze. Thanks to liCHi-C, the scientific community can explore the special regulation of gene expression.For example, in malignant transformation only in a specific clonal sub-population inside a tumor.

liCHi-C bietet die Möglichkeit, mit nur 50.000 Zellen qualitativ hochwertige und hochauflösende genomweite Promotor-Interaktombibliotheken zu generieren53. Dies wird erreicht, indem – neben der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Verwendung von DNA-Plasticware mit geringer Bindung im gesamten Protokoll – unnötige Schritte aus dem ursprünglichen Protokoll entfernt werden, bei denen erhebliche Materialverluste auftreten. Dazu gehören die Phenolreinigung nach der Entkreuzun...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations at JoVE.com

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Mit liCHi-C versuchen wir vor allem die Frage zu beantworten, wie das Chromatin im Zellkern interagiert und damit eine neue Ebene der Genregulation zu verstehen. Mit liCHi-C haben wir nachgewiesen, dass wir die Genomorganisation einer bestimmten Probe erforschen, die nicht-kodierende Mutation, die mit einer Krankheit assoziiert ist, mit potenziell betroffenen Genen in Verbindung bringen und chromosomale Umlagerungen, wie zum Beispiel Translokationen, in Tumorproben nachweisen können. Jetzt können wir die 3D-Chromatin-Organisation von Narbenzelltypen, wie z.B. primären Stammzellen oder relevanten klinischen Proben, untersuchen.Unser Protokoll reduziert die Eingabematerialien sowie den Zeit- und Kostenaufwand, der erforderlich ist, um qualitativ hochwertige Daten zur Erforschung der Genomorganisation bei der Auflösung von Restriktionsfragmenten zu erhalten. liCHi-C erweitert die Reichweite des 3D-Chromatin-Organisationsfeldes und ermöglicht es uns, neue Zelltypen zu erforschen, die bisher nicht analysiert werden konnten. Dank liCHi-C kann die wissenschaftliche Gemeinschaft die spezielle Regulation der Genexpression erforschen.Zum Beispiel bei der malignen Transformation nur in einer bestimmten klonalen Subpopulation innerhalb eines Tumors.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

968 Aufrufe.  Josep Carreras Leukaemia Research Institute. Mit liCHi-C versuchen wir vor allem die Frage zu beantworten, wie das Chromatin im Zellkern interagiert und damit eine neue Ebene der Genregulation zu verstehen. Mit liCHi-C haben wir nachgewiesen, dass wir die Genomorganisation einer bestimmten Probe erforschen, die nicht-kodierende Mutation, die mit einer Krankheit assoziiert ist, mit potenziell betroffenen Genen in Verbindung bringen und chromosomale Umlagerungen, wie zum Beispiel Translokationen, in Tumorproben nachweisen können. Jetzt k...

Serie: Autor im Rampenlicht: Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der promotorzentrierten räumlich-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen  

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

Forschung

Genetik

Lysis and Digestion of Scarce Cells

To begin, take an aliquot of frozen scarce cells and add 1 milliliter of cold lysis buffer to disrupt the cell membrane. Incubate the cells on ice for 30 minutes, mixing by inversion every five minutes. Centrifuge the nuclei for 10 minutes at 1, 000 G.Remove the supernatant and re-suspend the nuclei in 500 microliters of cold 1.25X restriction buffer 2.Then add 5.5 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate, mix by vortexing and incubate in a thermo block. Then quench the SDS by adding 37.5 microliters of 10%Triton X-100. Mix and incubate the sample as demonstrated earlier.Add 7.5 microliters of Hind III to digest the chromatin mix the solution and incubate overnight at 37 degrees Celsius.

Lyse und Verdauung knapper Zellen

Ligation and Decrosslinking of Scarce Cell DNA

To begin, take the digested scarce cell's DNA and place it on ice. Prepare a master mix by using the reagents required to fill in and biotinylate the restriction fragment overhangs. Incubate the sample at 37 degrees Celsius for 75 minutes, mixing by inversion every 15 minutes.Chill the sample on ice, and ligate the filled-in DNA ends by preparing a master mix using the reagents required for ligation. Finally, incubate the sample for four to six hours at 16 degrees Celsius, and then for 30 minutes at room temperature. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter of Proteinase K to decrosslink the chromatin.Mix the solution, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.

Ligation und Devernetzung seltener Zell-DNA

Sonication and Biotin Pull-Down of Scarce Cells DNA

After purifying the DNA, begin by taking ligated and decross-linked digested chromatin of the scarce cells. Set the water bath sonicator at a duty factor of 20%peak incidence power of 50 to 200 cycles per burst for 65 seconds, and a temperature range of 6 to 10 degrees Celsius, and sonicate the ligated and decross-linked digested chromatin. After end repairing the sample, transfer 150 microliters of C1 streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter tube.Place them on a 1.5 milliliter tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. Next, wash the beads by adding 400 microliters of Tween buffer and resuspending them with soft vortexing.Place the tube back in the magnet until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. After resuspending the beads, in 300 microliters of 2X No-Tween buffer or NTB, combine them with the 300 microliters of the sample.Finally, incubate for 15 minutes rotating at room temperature to pull down the informative DNA fragments with biotin.

Beschallung und Biotin-Pull-Down von seltener Zell-DNA

dATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA

DATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA  

To begin, take the scarce cell's DNA fragments pulled with biotin. Prepare a master mix by adding the reagents for dATP tailing and incubate the sample for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Then, inactivate Klenow exo-minus by incubating the sample for 10 minutes at 65 degrees Celsius and cooling it on ice.After washing the beads with 300 microliters each of TB, NTB, and 100 microliters of ligation buffer, resuspend them in 50 microliters of ligation buffer. Add four microliters of 15 micromolar pre-annealed adapter mix and one microliter of 2000 units per microliter T4 DNA ligase to the sample. Wash the beads with 400 microliters of TB, 200 microliters of NTB, and 100 microliters of restriction buffer two.After amplifying the library by PCR, pool all the 50 microliter reactions from the same sample into a 1.5 milliliter DNA low binding tube. Place it on a tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube and top up with TLE buffer to 500 microliters.To perform a double-sided selection using paramagnetic bead purification, add 200 microliters of stock beads to the library, mix by vortexing, and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Then, place the library on a magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.Concentrate the beads by taking 750 microliters of stock beads and placing them in a 1.5 milliliter tube on a magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant and resuspend the beads by vortexing in 300 microliters of new stock beads. Add 300 microliters of concentrated beads to the sample.Mix by vortexing and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Place on a magnet. Wait until all the beads are stuck to the wall and remove the supernatant.Wash the beads by adding one milliliter of 70%ethanol to the tube with the beads still on the magnet. Allow the beads to air dry and resuspend them in 21 microliters of TLE buffer by vortexing. To elute the library from the beads, incubate the sample for 10 minutes at 37 degrees Celsius in a thermoblock.Place the tube in a magnet and transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.

dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation seltener Zell-DNA

Library Capture, Biotin Pull-Down, and PCR Amplification Using Scarce Cell DNA Library

Begin by taking 500 to 1000 nanograms of the scarce cell DNA library. Dry the DNA with a vacuum concentrator and resuspended it in 3.4 microliters of nuclease-free water. After adding the blockers, and while on the thermocycler, at 65 degrees Celsius, transfer the hybridization solution with the biotinylated RNA to the blocked library.After closing the tube lid firmly, incubate in the thermocycler overnight at 65 degrees Celsius. Then transfer 50 microliters of T1 Streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter DNA low binding tube and place them on a 1.5 milliliter tube magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant leaving the beads behind.Now wash the beads thrice with 200 microliters of the binding buffer from the target enrichment kit and resuspend the beads in 200 microliters of binding buffer. Transfer the sample to the resuspended beads while on the thermocycler and incubate for 30 minutes. After washing the beads with 200 microliters of wash buffer 1, incubate them for 15 minutes, rotating at room temperature.Then wash the beads thrice with 200 microliters of wash buffer 2 heated to 65 degrees Celsius and incubate in a thermo block. Finally, after amplifying the library by PCR, perform a DNA purification using paramagnetic beads by adding 270 microliters of stock beads to the sample and mixing by vortexing. An automated electrophoresis profile from a library, just before capture, provided 49.7 nanograms per microliter of DNA in 20 microliters reaction volume.However, 3.06 nanograms per microliter of DNA is obtained from a high sensitivity automated electrophoresis profile from a finished leachic library.