Wir danken Amy Chen für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Videodreh und zur Demonstration der Technik. Diese Arbeit von ENIGMA durchgeführt: Ökosysteme und Netzwerke integriert mit Gene und molekulare Baugruppen (http://enigma.lbl.gov), ein Scientific Focus Area Programm am Lawrence Berkeley National Laboratory, wurde durch das Amt für Wissenschaft, Amt für Biologische und unterstützt Umweltforschung, des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH11231.

Hinweis: Die unten Protokoll wird für die Bestimmung von Gen-Ziele der RR DVU3023 aus dem Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough zugeschnitten. Es können zu jedem anderen Transkriptionsregulator von Interesse angepasst werden. 1. Clone und Entschlacken RR <ol><li> Klonen Sie die RR-Gen, insbesondere DVU3023, aus D. vulgaris Hilden in einem Escherichia coli-Expressionsvektor, so dass das Gen C-terminal His-markiert und Expression unter der Kontrolle eines T7-Promotors. Hinweis: Mehrere Klonierungsverfahren kann verwendet werden und wird durch den Forscher bestimmt. Alternative Affinitäts-Tags können auch verwendet werden. </li><li> Den Ausdruck in E. konstruieren coli BL21 (DE3) Expressionsstamm. </li><li> Aufwachsen 1 L des Expressionsstamm BL21 bei 37 ° C. In der Mitte der log-Phase, fügen IPTG 0,5 mM bis Proteinexpression induzieren. Weiterhin Wachstum bei Raumtemperatur für 24 Stunden. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 5000 × g für 10 Meilenn bei 4 ° C Die Zellen in Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol, 1 mg / ml Lysozym, 1x Nuklease Benzonase). Lysieren Zellen unter Verwendung eines Französisch-Presse bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Lysats bei 15.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Filter mit einem 0,45 um Spritzenfilter. </li><li> Auf einem FPLC-Gerät unter Verwendung von 10 ml Waschpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol) waschen ein 1-ml-Ni-Sepharose-Säule. </li><li> Laden Lysat auf die Säule. Mit 20 ml Waschpuffer waschen Spalte. </li><li> Eluat DVU3023 Verwendung eines Gradienten von 0-100% Elutionspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol). </li><li> Laden eluierten Fraktionen auf eine Entsalzungssäule und Waschen mit einem Entsalzungspuffer (20 mM Natriumphosphat pH 7,4, 100 mM NaCl). </li><li> Zentrifuge Proteinprobe in einem Hochmolekulargewichts-Cutoff-Filter-Zentrifuge, um das Protein zu konzentrieren. Hinzufügen DTT und 0,1 mM und Glycerin 50% Protein und Speicher bei -20 ° C. Hinweis: Reinigungsverfahren müssen individuell für jede untersuchte Protein optimiert werden. </li></ol> 2. Bestimmen Gene Ziel für RR Mit elektrophoretische Mobilität Shift-Assay (EMSA) <ol><li> PCR amplifizieren 400 bp-Region stromaufwärts von der Kandidatenzielgens DVU3025 mit D. vulgaris Hilden genomischer DNA als Matrize und einen vorderen unmarkierten Primer und ein Rückwärts 5&#39;-Biotin-markiertem Primer. Hinweis: Tipps, um einen Kandidaten Zielgens wählen: Oft RRs binden die vorgelagerten Bereiche des eigenen Gen / Operon, oder sie können proximal codierten Gene regulieren. Wenn der RR hat Orthologe in anderen Spezies, suchen nach Genen, die in der Nachbarschaft konserviert sind. Alternative Methoden gehören die Auswahl von Kandidatengenen auf Basis Regulon Vorhersagen (zB RegPrecise 5) oder die Vorhersage sigma54-abhängigen Promotoren 6 für RRs, die sich sigma54 abhängig sind. </li><li> Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% Agarose-Gel, schneiden Sie die 400 bp große Produkt und reinigen die DNA mit einem Gel Extraktion Kit bereinigen. </li><li> Mischen DVU3023 Protein (0,5 pmol) mit 100 fmol der biotinylierten DNA-Substrat in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25% Glycerin und 1 &amp;mgr; g / ml Poly dI.dC (Nicht spezifischen Kompetitor-DNA) in einem Gesamtvolumen von 20 pl. Auch eine Reaktion ohne Protein als Kontrolle gesetzt. Inkubiere die Reaktion bei Raumtemperatur auf der Bank 20 min. </li><li> Anmerkung: Dies sind aufgelistet und in Abhängigkeit von der RR von Interesse können auch andere Reaktionskomponenten zugesetzt werden Standardbedingungen. Wenn die Aktivierung gewünscht, 50 mM Acetyl-Phosphat zu der Reaktion (oft RRs wird DNA in vitro zu binden, ohne Aktivierung). </li><li> Vorlauf eine Fertig mini 6% Polyacrylamid-Gel in 0,5 x TBE 0,5 x TBE-Puffer bei 100 V für 30 min. In 5 ul 5x Ladepuffer (0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanol, 30% Glycerin in 1x TBE) auf die Bindungsreaktionen und Last 18 ul der Reaktionen auf die gel. Führen Sie bei 100 V für 2 Stunden. Hinweis: Um eine Überhitzung, die Dissoziation des Protein-DNA-Komplexe führen kann, füllen die äußere Pufferkammer in der Elektrophorese-System mit Laufpuffer, so dass die Mehrheit des Gels wird durch Puffer isoliert vermeiden. Alternativ kann das Gel bei 4 ° C ausgeführt werden, </li><li> Schnitt eine geladene Nylonmembran für die Größe des Gels und genießen sie in 0,5 x TBE für mindestens zehn Minuten. Entfernen Sie das Gel der Kassette. Schneiden Sie keine Kämme aus dem Gel und Sandwich-Gel und die Membran zwischen zwei in 0,5 x TBE getränkt dicke Filterpapiere und legen in einem Halbtrocken Blotapparatur und laufen bei 20 V für 30 min. </li><li> Legen Sie die Membran in einem kommerziellen UV-Licht Vernetzungsinstrument und die Zeit auf 3 min. Hinweis: Die Membran kann nun trocken bei Raumtemperatur für mehrere Tage, bevor zum nächsten Schritt gespeichert werden. </li><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen Chemilumineszenznachweis-Kit, das eine Streptavidin-Meerrettich peroxida beschäftigtse-Konjugat, das Blot nach Herstellerangaben zu entwickeln. </li><li> Bild der Blot unter Verwendung eines Computers angeschlossen an eine CCD-Kamera ausgestattet ist und nach einer Verschiebung in der Mobilität des DNA-Substrats in Gegenwart des RR, die anzeigt, dass der RR bindet die DNA getestet. Hinweis: Die Spezifität der DNA-Protein-Verschiebung kann, indem in die Reaktions einen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor-DNA, die Beseitigung oder Verringerung der Verschiebung gesehen sollte getestet werden. </li></ol> 3. Überprüfen Target Enrichment nach Genomic DNA-Protein-Bindung <ol><li> Genomic DNA-Protein-Bindungsreaktion <ol><li> Scher genomischen DNA auf eine durchschnittliche Größe von 500 bp durch Beschallen 100 &amp;mgr; l genomische DNA (bei Konzentrationen von 100-200 ng / &amp;mgr; l) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Mikrospitze mit 9 Impulsen niedriger Amplitude von 1 Sekunde, 2 Sekunden Lücke zwischen jeden. Hinweis: Wenn die DNA spritzt an den Seiten der Röhre, Spin-Down der Inhalt nach jeweils 3 Impulse. Die genauen Bedingungen verwendetwird mit dem Ultraschallgerät Instrument variieren. Die gescherten DNA-Fragmente können von 100-1000 bp liegen, aber die mittlere Größe innerhalb von 400-600 bp. Zu viel Scher kann in weniger intakte Bindungsstellen führen und entweder zu viel oder zu wenig Scher Bibliothek wird während der Herstellung nachgelagerten Amplifikation des gesamten Genoms Schritte beeinflussen. </li><li> Mischen 2-3 ug genomische DNA geschert mit RR-Protein (0,5 pmol DVU3023) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 25% Glycerin und 50 mM Acetyl-Phosphat. Reaktionen Inkubieren bei 25 ° C für 30 min. Übertragungs 10 ul dieser Reaktion auf eine 1,5-ml-Röhrchen und Etikett als Eingangs DNA. Hinweis: Acetyl-Phosphat zugesetzt wird, um das Protein durch in vitro-Phosphorylierung zu aktivieren. Die Phosphorylierung stimuliert die DNA-Bindung, aber viele RRs binden auch DNA in vitro 7 ohne Aktivierung. Die Proteinmenge der Reaktion zugegeben wird auf die Aktivität des Proteins prep abhängen. Die EMSA kann verwendet werden, um zu entscheiden seinimize Betrag. </li></ol></li><li> Affinity reinigen die Protein-gebundener DNA <ol><li> Hinzufügen von 30 &amp;mgr; l Ni-NTA-Agarose-Harz zu einem 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 100 g für 1 min, um das Harz am Boden zu sammeln, und den Überstand entfernen. 100 ul Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 25% Glycerin), Flick das Rohr zu mischen und Zentrifuge bei 100 × g für 2 min. Überstand entfernen. </li><li> Die restlichen 90 &amp;mgr; l der Bindungsreaktion zu der gewaschenen Ni-NTA-Harz und Inkubieren in einem Rundschüttler für 30 min. </li><li> Zentrifugieren bei 100 g für 2 min, und entfernen Sie den Überstand (ungebundene DNA). 100 l Waschpuffer, Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen und Zentrifuge bei 100 g für 2 min. Überstand entfernen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal. </li><li> Mit 35 &amp;mgr; l Elutionspuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol) zum Harz und vortexen. Inkubieren auf der Bank bei RT für 5 min. Zentrifugieren bei 100 g für 2 min. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und Etikett wie das Protein-gebundenen DNA-Fraktion. </li><li> Fügen auch 35 ul des Elutionspuffers mit dem Eingang DNA. </li><li> Reinige den Eingangs-und die Protein-gebundenen DNA-Fraktionen unter Verwendung eines PCR-Reinigungskits. </li></ol></li><li> Gesamte Genom verstärken die Ein-und Protein-gebundener DNA-Proben. <ol><li> Werden 10 ul der Eingangs-und Protein-gebundenen DNA-PCR-Röhrchen zu trennen. 1 ul 10x Fragmentation-Puffer, 2 ul Bibliothek Präparationspuffer und 1 ul Bibliothek Stabilisierungslösung zu jeder Probe. Durch Vortexen mischen. Hitze in einem Thermocycler bei 95 ° C für 2 min, und Chill auf Eis. Hinweis: Der Ausgangsbetrag der DNA sollte mindestens 10 ng um zu vermeiden, die Einführung Verstärkung Bias sein. </li><li> 1 ul der Bibliothek Vorbereitung Enzyme, mischen durch Pipettieren, und Inkubation im Thermocycler bei 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C für 20 min, 75 ° C / 5 min, Und halten bei 4 ° C </li><li> Zu jedem Röhrchen hinzugefügt 47,5 &amp;mgr; l Wasser, 7,5 ul 10x-Amplifikation Master-Mix und 5 ul Polymerase. Gut mischen und Wärme bei 95 ° C / 3 min, gefolgt von 20 Zyklen von 94 ° C/15 sec, 65 ° C / 5 min. Halten Reaktionen bei 4 ° C </li><li> Reinige die amplifizierte DNA-Proben unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kit und DNA-Konzentration spektrophotometrisch messen. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, Zielanreicherung in der Protein-gebundener DNA mit Hilfe der qPCR <ol><li> Design-qPCR-Primer 200 bp der stromaufwärts gelegenen Bereich der EMSA-prüft Zielgens (DVU3025) mit jedem frei zur Verfügung Primer-Design-Software zu verstärken. </li><li> Bis dreifach qPCR Reaktionen für jede DNA-Vorlage mit jedem Primer-Set ein. Bereiten Sie ein Master-Mix für jedes Primer-Set. 1x Master-Mix enthält 10 ul 2x SYBR Green qPCR-Mix, 0,5 uM von jedem Primer und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 18 ul. Aliquot 18 ul des Master-Mix pro Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. </li><li> DILUTe das verstärkte und gereinigt Eingangs-und Protein-gebundener DNA-Proben zu 5 ng / ul mit Wasser und verwenden als DNA-Vorlage. In 2 ul DNA-Vorlage in die Vertiefungen. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem extrem klare qPCR Siegelfolie, Spin-down-Platte in einer Zentrifuge bei 200 xg / 1 min. Zeigen Platte in Echtzeit qPCR Maschine. Zyklus wie folgt unter Verwendung der zugehörigen Software qPCR: 95 ° C / 1 min, 40 Zyklen von 95 º C/10 sec, 59 º C/15 sec, 70 º C/35 sec. </li><li> Auch bis dreifacher Ausfertigung qPCR-Reaktionen mit Primern gesetzt zu den vorgelagerten Regionen eines nicht verwandten Gen (Negativkontrolle) zu verstärken. </li><li> Berechnen &amp;Dgr; T durch Subtrahieren C T-Wert von proteingebundenen DNA von dem der Ausgangs-DNA. Berechnen fache Anreicherung des Zielgens in der DNA-Protein-gebundenen als 2 &amp;Dgr; C T. Hinweis: Wenn der Ziel upstream-Region wurde in der Protein-gebundener DNA gegen den Eingang DNA angereichert ist, zeigt dies, dass die Bindungsreaktionen und Affinitätsreinigung waren successful. Fahren Sie mit Schritt 4 fort. Wenn Anreicherung der Ziel-Region stromaufwärts wurde nicht beobachtet, wiederholen Sie die Bindungsreaktionen (Schritt 3.1) mit verschiedenen Proteinmenge. </li></ol></li></ol> 4. DNA Labeling-und Array-Hybridisierung <ol><li> Label-Eingabe-DNA mit Cy3 und Cy5-DNA mit Enriched Anmerkung: Cy3-und Cy5-Farbstoffe sind lichtempfindlich und sollte darauf geachtet werden Lichtexposition auf ein Minimum zu halten. <ol><li> Mischen Sie 1 ug DNA mit 40 ul Cy3/Cy5-labeled 9-mers und die Lautstärke anpassen, um 80 ul mit Wasser. </li><li> Hitze denaturiert bei 98 ° C für 10 min im Dunkeln (in einem Thermocycler). Schnellkühl auf Eis für 2 min. </li><li> Add 2 ul Klenow-Polymerase (3&#39;-5&#39;-exo - 50000 U / ml), 5 mM dNTPs und 8 &amp;mgr; l Wasser zu jedem Reaktions, gut mischen, und bei 37 ° C für 2 h im Dunkeln (in ein Thermocycler). </li><li> In EDTA bis 50 mM, um die Reaktion und NaCl-Lösung auf 0,5 M. stoppen </li><li> Über Proben zu 1,5 ml Röhrchen containing 0,9 Volumen Isopropanol, Inkubation im Dunkeln für 10 min und Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min. Das Pellet sollte rosa für Cy3-markierte DNA und blau für Cy5-markierte DNA sein. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 80% Ethanol (500 ul) und Zentrifugation bei 12.000 × g für 2 min. Klima trockenen Pellets für 5-10 min im Dunkeln. Hinweis: Die Pellets können bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Pellet in 25 ul Wasser. Messen Sie die DNA-Konzentration spektrophotometrisch. </li><li> Pool zusammen 6 ug jeder der Cy3-und Cy5-markierte DNA in einem 1,5-ml-Röhrchen und Vakuumtrocken in einer Zentrifuge bei schwacher Hitze in der Dunkelheit (decken den Zentrifugendeckel, wenn es transparent ist). Hinweis: Pellets kann bei -20 ° C bis bereit für die Hybridisierung gespeichert werden. </li></ol></li><li> Microarray-Hybridisierung <ol><li> Drehen Sie den Hybridisierungssystem auf 3-4 Stunden vor der Verwendung und die Temperatur auf 42 ° C </li><li> Bereiten Sie eine Hybridisierungslösung Master-Mix, so dass 1x Lösung enthält 11,8 ul 2x Hybridirung Puffer, 4,7 ul Hybridisierung Komponente A und 0,5 ul Ausrichtung Oligo. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 5 ul Wasser. Add 13 ul dieser Mischung auf die Probe. Vortex für 15 Sekunden, Inkubation bei 95 ° C in einem Trocken Bad für 5 min. Halten Proben bei 42 ° C in der Hybridisierungssystem bis zum Laden bereit. </li><li> Vorbereitung der Mikroarray-Objektträger-Mischeranordnung gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Setzen Sie den Mixer-Schlittenanordnung innerhalb des Hybridisierungssystems. Last 16 ul Probe in die Einfüllöffnung abdichten Ports mit einer Klebefolie, drehen Mischen auf in dem System, und hybridisieren für 16-20 h bei 42 ° C. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer I (250 ml), II (50 ml) und III (50 ml) durch Verdünnen der 10x kommerziell verfügbaren Puffer in Wasser, und jeweils 1 mM DTT hinzufügen. Warme Puffer I auf 42 ° C </li><li> Schieben Sie die Mixer-Folie in einem Demontagewerkzeug, Ort und in einer Schale mit warmem Puffer I. Peel der Mischer aus, während kräftig shnter den Demontagewerkzeug von Hand. </li><li> Zeigen Sie die Folie in einen Behälter mit 50 ml Waschpuffer I und kräftig schütteln für 2 min mit der Hand. </li><li> Transferschlitten in einen zweiten Behälter mit 50 ml Waschpuffer II und kräftig schütteln für 1 min mit der Hand. </li><li> Transferschlitten in einen dritten Behälter mit 50 ml Waschpuffer III und kräftig schütteln für 15 Sekunden von Hand. </li><li> Blot schnell die Ränder der Folie auf ein Papiertuch und legen in einer Dia-Rack. Zentrifugieren bei 200 g für 2 min, um die Diashow zu trocknen. Legen Sie innerhalb Dia Fall, wickeln Sie es mit Folie, und speichern Sie in einem Exsikkator. </li></ol></li><li> Scannen des Array <ol><li> Den Objektträger in der Microarray-Scanner nach den Anweisungen des Instruments. </li><li> Verwenden Sie eine Scanner-Software, um die Wellenlängen 532 nm = Cy3 und Cy5 = 635 nm eingestellt, und die ersten Photomultiplier Gewinne zwischen 350 und 400. </li><li> Vorschau auf die Folie, um das Array auf der Folie zu finden. Wählen Sie das Array-Bereich für das Scannen. </li&gt; <li> Scannen Sie den Array und stellen die Photomultiplier-Einstellungen, so dass die Array-Funktionen sind meist gelb. Das Histogramm sollte die rote und grüne Kurven überlagert oder so nah wie möglich beieinander zu zeigen. Die Kurven sollten über den 10 -5 normalisierte zählt bei Sättigung beenden. </li><li> Sparen Sie separat beide 532 und 635 nm Bilder. </li></ol></li><li> Array-Datenanalyse <ol><li> Importieren Sie die Bilder in ein Array-Analyse-Software. Mit der Software erstellen Sie zwei Paar Berichte (. Paar) für jedes Array (für Cy3 und Cy5-Bilder). Neues skalierte Protokoll 2-Verhältnis Dateien mit den Paar-Dateien. Verwenden Sie log 2 Verhältnis Dateien für Spitzen mit einem Schiebefenster von 500 bp suchen. Karte des Spitzen Loci zu den vorgelagerten Bereiche des Gen-Targets. </li><li> Prüfen Sie, ob der positive Ziel (bestimmt mit EMSA und qPCR, DVU3025 in diesem Beispiel bestätigt) innerhalb der oberen Spitzen erscheint. Hinweis: Wenn das positive Ziel ist nicht unter den Top-Hits, ist es möglich, dass die RR unter consideration mehrere Gen-Targets und replizieren DAP-Chips durchgeführt werden kann und die Spitzen, die für alle Wiederholungen verwendet werden, um eine Zielliste erzeugt. </li></ol></li></ol> 5. Binding Site Motiv Vorhersage und Validierung <ol><li> Rufen Sie Sequenzen für Upstream-Regionen (400 bp) für die Top-Gen-Targets wie DAP-Chip-Analyse erzeugt. Bewerben MEME dieser Sequenzen durch Mikroben Online (meme.nbcr.net), um Motive vorherzusagen. Hinweis: Enhancer-Bindungsproteine ​​wie sigma54 abhängigen Regler können mehrere hundert Basenpaare stromaufwärts von der Startstelle zu binden. Für andere Transkriptionsregulatoren eine kürzere Region wie 200 bp stromaufwärts ausreichen. </li><li> Design-Ober-und Unter DNA-Oligomere, die die vorhergesagte Bindungsstelle Motiv von 10 Basen an beiden Enden flankiert enthalten. Bestellen Sie den oberen Strang 5 &#39;biotinyliert. </li><li> Mischen der oberen und unteren Strang Oligos Verhältnis 1:1,5 in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 50 mM NaCl inein Gesamtreaktionsvolumen von 20 ul in PCR-Röhrchen. Hitze auf 95 ° C für 5 min in einem thermischen Cycler, gefolgt von langsamem Abkühlen auf 25 ° C. Verdünnen Sie das Zehnfache und die Verwendung als Wildtyp-dsDNA-Substrat für die EMSA. </li><li> Vorbereitung modifizierten Substraten unter Verwendung der gleichen Schritte wie oben, aber Design Oligomere 4-6 Substitutionen in der konservierten Basen der Bindungsmotiv tragen. </li><li> Richten Sie Bindungsreaktionen mit dem RR und dem Wildtyp-oder modifizierte Substrate und untersuchen mittels EMSA, wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Hinweis: Die vorhergesagte Motiv wird validiert, wenn die RR bindet den Wildtyp-Substrat, aber nicht die modifizierte ein. </li></ol> 6. Erhaltung der Motif in anderen verwandten Bakterienarten <ol><li> Wählen Genome von Interesse, dass Orthologe DVU3023 enthalten. Erhalten Folge und Anmerkungsdateien für den Genomen von der NCBI-Website. </li><li> Verwenden Sie eine Programmiersprache wie Perl-Skripte, die die Motiv-Sequenzen aus der DAP-Chip-Ziele verwenden, um eine pos bauen schreibenition gewichteten Matrix und verwenden Sie die Matrix, in anderen sequenzierten Genomen vorhanden ähnliche Motive punkten. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offen zu legen.

Die hier beschriebene DAP-Chip-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Gen-Targets für mehrere RRS in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7, von denen eine hier als repräsentatives Ergebnis gezeigt zu bestimmen. Für RR DVU3023, die Wahl eines Kandidaten-Gen Ziel war einfach. DVU3025 ist unmittelbar stromabwärts von der RR-Gen und die RR-und Zielgene werden in mehreren Desulfovibrio-Arten konserviert sind, und zusätzlich eine vorhergesagte DVU3025 sigma54-abhängigen Promotor. Die ...

Die Fähigkeit der Bakterien zu überleben und zu gedeihen ist kritisch davon abhängig, wie gut sie in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um Störungen in ihrer Umgebung sind, und diese wiederum ist abhängig von der Signalübertragungssysteme. Die Anzahl der Signalanlagen ein Bakterium kodiert wurde seine &quot;mikrobielle IQ&quot; bezeichnet und kann ein Hinweis sowohl Variabilität der seine Umwelt und seine Fähigkeit, mehrere Signale zu erfassen und eine Feinabstimmung seiner Antwort 1 sein. Zwei-Komponenten-Signalübertragungssystemen (ASR) sind die am weitesten verbreiteten Signalsysteme von Bakterien verwendet werden, und sie bestehen aus einem Histidin-Kinase (HK), der das externe Signal erfasst und überträgt über die Phosphorylierung an ein Effektor-Antwortregulator (RR) 2 bestehen. RR kann eine Vielzahl von Ausgangsdomänen und damit unterschiedliche Effektor-Modi, aber die häufigste Antwort Transkriptionsregulation über eine DNA-bindende Domäne 1. Die erfassten Signale und die entsprechenden Funktionen des Vast Mehrheit der FKS vor unbekannt. Obwohl in vivo-Methoden wie Chip-Chip werden routinemäßig für die Bestimmung von genomischen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren 3 verwendet wird, kann sie nur für bakterielle Zweikomponentensystem-Ressourceneinträge verwendet, wenn die Aktivierungsbedingungen oder Signale bekannt sind. Oft sind die Umweltreize, die einen TCS aktivieren sind härter als ihre Gen-Targets zu bestimmen. Die in vitro-Mikroarray-basierten hier beschriebene Assay kann verwendet werden, um die Gen-Targets wirksam und schnell zu bestimmen und vorherzusagen Funktionen FKS werden. Dieser Assay nutzt die Tatsache, dass RRS phosphoryliert und somit mit kleinen Molekülen wie Acetyl Geber Phosphat 4 in vitro aktiviert. Bei diesem Verfahren, genannt DAP-DNA-Chip für affinitätsgereinigtem-Chip (1), das RR-Gen von Interesse mit einem His-Tag kloniert, in E. coli, und eine anschließend gereinigt markierte Protein wird bi erlaubtnd genomische DNA geschert. Die an Protein gebundene DNA wird dann durch Affinitätschromatographie-Aufreinigung angereichert werden die angereicherten und Input-DNA amplifiziert, fluoreszenzmarkierten, gepoolt und auf ein Array, das individuelle Fliesen auf den Organismus von Interesse (1) hergestellt wird, hybridisiert. Mikroarray-Experimenten unterliegen Artefakte und daher zusätzliche Schritte verwendet werden, um den Assay zu optimieren. Ein solcher Schritt ist, zu versuchen, ein Ziel zu bestimmen, unter der RR-Studie unter Verwendung von elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) (siehe Arbeitsablauf in Fig. 2). Dann, nach der Bindung an genomische DNA und die DAP Schritte, die proteingebundene und die Input-DNA durch qPCR untersucht, ob die positive Ziel in der proteingebundenen Fraktion gegenüber dem Eingangsfraktion angereichert, wodurch bestätigt optimaler Bindungsbedingungen für die RR (Fig. 2). Anordnung nach Hybridisierung werden die Daten analysiert, um Peaks höherer Intensität anzeigendes Signal genomischen Loci zu finden, wo das Protein had gebunden. Funktionen für die RR auf der Grundlage der vorhergesagten Gen-Targets erhalten werden. Die Ziel-Loci verwendet werden, um Bindungsstelle Motive, die dann experimentell mit EMSA (Abbildung 2) bestätigt werden vorherzusagen. Die Funktionsvorhersagen und Gen-Targets für die RR kann dann verlängert werden, um eng verwandte Arten, die orthologen RRs kodieren durch das Scannen dieser Genome für ähnliche Bindungsmotive (Abbildung 2). Der DAP-Chip-Verfahren kann eine Fülle von Informationen für ein TCS wo vorher da war keiner zu liefern. Das Verfahren kann auch für jede Transkriptionsregulator verwendet werden, wenn das Protein gereinigt und DNA-Bindungsbedingungen bestimmt werden können, und für jeden Organismus von Interesse mit einer Genomsequenz vorhanden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Die DNA-Affinitäts-gereinigten-Chip-(DAP-Chip)-Strategie 7. Die RR-Gens aus dem Organismus von Interesse ist mit einem Carboxy-terminalen His-Tag in einen E. kloniert coli Expressionsstamm. Gereinigte His-markierte Protein durch Phosphorylierung mit Acetylphosphat aktiviert und mit geschnittenen genomischen DNA gemischt. Ein Aliquot der Bindungsreaktion als Eingangs DNA gespeichert, während der Rest der Affinitätsreinigung unter Verwendung von Ni-NTA-Harz unterzogen. Der Eingang und der RR-gebundene DNA sind ganze Genom amplifiziert und mit Cy3 bzw. Cy5 markiert. Die markierte DNA wird zusammen gebündelt und zu einem Kachelanordnung, die dann analysiert wird, um die Gen-Targets zu bestimmen, hybridisiert. Abbildung modifiziert und neu aufgelegt mit der Creative-Commons-Lizenz von 7. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Zusammenfassung der Workflow. Für gereinigt getaggt protein, beginnen mit der Bestimmung eines Ziel mittels EMSA. Lassen Protein, um genomische DNA und DNA-Affinität-Entschlackung (DAP) und des gesamten Genoms binden verstärken (WGA) angereichert und die Input-DNA. Wenn ein Ziel-Gen bekannt ist, verwenden qPCR um sicherzustellen, daß der bekannte Target in der proteingebundenen Fraktion angereichert. Wenn kein Ziel ermittelt werden konnte, gehen Sie direkt zur DNA-Markierung und Array-Hybridisierung. Wenn Anreicherung durch qPCR konnte nicht beobachtet werden, wiederholen Sie den Protein-gDNA-Bindung und DAP-WGA Schritte mit unterschiedlichen Proteinmengen. Verwenden Array-Analyse Spitzen finden und sie den Zielgene. Verwenden Sie die vorgelagerten Bereiche des Zielgene zu Bindungsstelle Motive vorherzusagen. Bestätigen Sie die Motive experimentell unter Verwendung EMSAs. Verwenden Sie das Motiv, die Genome verwandter Arten Orthologe des RR-Studie unter Codierung zu scannen, und vorherzusagen, Gene in diesen Zielarten als gut. Basierend auf den Gen-Targets erhalten werden, kann die physiologische Funktion des RR und ihre Orthologe vorhergesagt werden. Abbildung modifiziert und neu aufgelegt mit der kreativen commons Lizenz von 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

In-vivo-Methoden wie Chip-Chip sind etablierte Techniken zur globalen Zielgene für Transkriptionsfaktoren zu bestimmen. Von begrenztem Nutzen sind sie jedoch in der Erforschung bakteriellen Zwei-Komponenten-Regulationssysteme mit charakterisierter Aktivierungsbedingungen. Solche Systeme regulieren die Transkription nur, wenn in Gegenwart von eindeutigen Signalen aktiviert. Da diese Signale oft unbekannt sind, können in diesem Video-Artikel beschriebene in vitro-Mikroarray-basierten Verfahren verwendet werden, um Gen-Targets und Bindungsstellen für Antwortregulatoren zu bestimmen. Diese DNA-Affinitäts-gereinigten-Chip-Verfahren kann für jede gereinigte Regler in jedem Organismus mit einem sequenzierten Genom verwendet werden. Das Protokoll beinhaltet wodurch die gereinigte markierte Protein zu scher genomische DNA binden und Affinitätsreinigung des proteingebundenen DNA, gefolgt von der fluoreszierenden Markierung der DNA und Hybridisierung an eine individuelle Unterteilung Array. Vorhergehenden Schritte, die verwendet werden, um den Test zu optimieren Spezifikationen werden könnenc Regler werden ebenfalls beschrieben. Die von der Array-Daten-Analyse erzeugten Peaks werden verwendet, um Bindungsstelle Motive, die dann experimentell validiert werden vorherzusagen. Die Vorhersagen Motiv kann weiter verwendet werden, um Gen-Targets orthologer Antwortregulatoren in nahe verwandten Arten zu bestimmen. Wir zeigen die Anwendbarkeit dieser Methode durch Bestimmung der Gen-Targets und-Bindungsstelle Motive und damit die Vorhersage der Funktion für ein sigma54 abhängige Antwortregulator DVU3023 in der Umwelt Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Das oben genannte Verfahren wurde angewendet, um die globalen Gen-Targets der RRS in der Modellsulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 zu bestimmen. Dieser Organismus besitzt eine große Anzahl von FKS über 70 RRs dargestellt, was auf die Vielzahl von möglichen Signalen, die es erfaßt und darauf reagiert. In-vivo-Analysen der Funktionen dieser Signalanlagen schwer, da ihre Signale führen und somit ihre Aktivierungsbedingungen sind unbekannt. Hier wurde die D...

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DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.6K Aufrufe.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen. 

Serie: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the biliary tract in Suncus murinus (S. murinus&#160;). First, the specimen was dissected from S. murinus and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Second, an enzymatic treatment and potential endogenous peroxidase inactivation were performed. The specimen was then exposed to the primary antibody, anti-neurofilament protein antibody, for 3-6 days. It was then incubated with the secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The color reaction was revealed by reacting the specimen with a 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) substrate. This method can be applied to analyze the innervation of all visceral organs. Furthermore, this protocol can also be adapted to test other neuronal antibodies, but optimization of the antibodies should be done first. This method was originally introduced by Kuratani and Tanaka1,2,3.

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

A whole-mount immunohistochemical approach, to visualize neurofilament protein expression in the extrahepatic biliary tract in Suncus murinus. is presented here. This protocol can be used to analyze the innervation of all visceral organs in S. murinus or other species.

Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...