Diese Arbeit wurde teilweise durch New Innovator des NIH Director Award Program, Teil der NIH Roadmap for Medical Research, über Grant-Nummer 1-DP2-OD004309-01 unterstützt. SBS-N. möchte die NSF für ein Graduate Research Fellowship bedanken.

1. Pre-processing Tissue Vorbereitung <ol class="lalpha"><li> Bevor Sie dieses Protokoll, muss man schon dezellularisierte das Gewebe der Wahl. Für dieses Beispiel sind frisch vom Schwein und Mensch Herzbeutel Proben dezellularisierte mit hypotonischen und hypertonischen spült in deionisiertem Wasser (DI) und Natriumdodecylsulfat (SDS). </li><li> Insbesondere ersten Waschen der Schweine Herzbeutel in DI-Wasser für 30 Minuten, dann kontinuierlich rühren in 1% SDS in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 24 Stunden, gefolgt von einer 5-stündigen DI Wasser abspülen. Für Menschen pericardia, zuerst in DI Wasser spülen für 30 Minuten, dann rühren kontinuierlich in 1% SDS in PBS für 60-65 Stunden, gefolgt von einer Nacht DI spülen. Entfernen Sie alle Proben aus ihrer endgültigen Lösung und spülen Sie wieder unter fließendem Wasser 1 DI. </li><li> Um zu überprüfen, Dezellularisierung, entfernen Sie ein kleines Stück, frisch einfrieren in OCT Einfriermedium, und nehmen 10 pm Gewebeschnitten alle 100 um während der Probe für die Untersuchung über die histologische Analyse, wie bereits berichtet 34-36. </li><li> Verwenden Sie Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Flecken des Gewebes für das Fehlen von Kernen zu untersuchen. Man könnte auch eine fluoreszierende Hoechst 33342-Färbung (1,0 ug / ml) für die DNA, die H &amp; E-Ergebnisse zu überprüfen; kurz, fixieren Sie die Abschnitte, rehydrieren und in Wasser abspülen, Fleck für 10 Minuten, und dann gut ausspülen und dunkel lagern. Alternativ kann man ein Set wie das Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit, das entwickelt, um die Gesamt-DNA einer Probe zu quantifizieren ist. </li></ol> 2. Herstellung von injizierbaren ECM <ol class="lalpha"><li> Gefriertrocknung <ol class="lroman"><li> Nach entsprechender Vorbereitung, frieren die dezellularisierte Proben mit flüssigem Stickstoff oder durch Lagerung bei -80 ° C. Lyophilisieren die Proben bis es komplett trocken. Abhängig von Ihrem System und der Wassergehalt der Proben, kann dies dauern 12 bis 72 Stunden. </li></ol></li><li> Mahlen <ol class="lroman"><li> Einmal vollständig trocken ist, ist eine Wiley Mini Mill verwendet werden, um die trockene ECM zu einem feinen Pulver zermahlen. Wählen Sie die entsprechende Maschenweite für Ihre Zwecke, hier die 40 Gauge Mesh verwendet wird. Nachdem die Mehrheit der Probe durch den Filter gelangt ist, entfernen Sie die Sammelbüchse mit der gefrästen ECM Pulver. Wenn es nur eine kleine Probe, kann der Rest der Probe aus der Mühle in eine Vielzahl von Möglichkeiten extrahiert werden, hier ein Q-Tip wird verwendet, um die ECM hinter den Leitschaufeln der Mühle stecken zu entfernen. </li><li> Achten Sie immer darauf, dass die Mühle sauber und frei von Ablagerungen ist. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass sowohl die Mühle und Ihre Probe vollständig getrocknet sind, verbliebene Feuchtigkeit wird die ECM zu aggregieren und zu verklumpen Ursache, Vorbeugung erfolgreichen Fräsen. Das ECM kann abholen Feuchtigkeit aus der Luft und so sollte direkt aus dem Lyophilisator zur Mühle. </li></ol></li><li> Verdauung <ol class="lroman"><li> Zur Bildung des injizierbaren ECM, wird das Pulver Pepsin verdaut. Das folgende Protokoll wurde von Freyetes geändert, et al. (2). </li><li> Es ist wichtig, wie sterile ein Produkt wie möglich zu halten, wie es in vivo injiziert wird und Verunreinigungen können zu Komplikationen führen. So verwenden sterile Fläschchen und wiegen Löffel und Filter alle Lösungen vor dem Einsatz. Eine Lyophilisation Schritt nach dem Fräsen und vor der Verdauung hilft auch der Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Wiegen Sie die gewünschte Menge an ECM-Pulver in ein geeignetes Scintillationsfläschchen. Für Gesamtvolumen von weniger als 1 mL, ist es ratsam, mit einem 2-ml-Fläschchen und für größere Mengen, ein 20 ml-Fläschchen. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Flüssigkeit am Boden des Fläschchens, effektiv zu rühren. </li><li> Wiegen Sie die gewünschte Menge von Pepsin in ein Szintillationsfläschchen. Add 0,1 M HCl, so dass die Pepsin in einer Konzentration von 1 mg / mL ist. Stellen Sie sicher, das Pepsin vollständig aufgelöst ist (keine Partikel) vor dem Gebrauch dieser durch Vortexen der Pepsin-Lösung kann beschleunigt werden. </li><li> Fügen Sie die Pepsin / HCl-Lösung, die Scintillationsfläschchen mit dem ECM-Pulver, so dass die ECM in einer Konzentration von 10 mg / mL ist. </li><li> Stir-Lösung kontinuierlich für 60-65 Stunden, in regelmäßigen Abständen Kratzen an den Seiten des Fläschchens mit einem Gewicht von Löffel oder Spatel. </li></ol></li><li> pH-Regelung <ol class="lroman"><li> Dieser Schritt wird durchgeführt, um die Flüssigkeit Matrixmaterial zu physiologischen pH-Wert zu bringen und die Pepsin inaktivieren, halten sie von Spaltung der ECM weiter. Auch sicher sein, zu filternden Lösungen mit Millipore-Wasser zu verwenden. </li><li> 1 M NaOH zugesetzt wird, um 1 / 10 des ursprünglichen Volumens werden. Testen Sie den pH-Wert an diesem Punkt und fügen kleine Mengen (2-10 ul) von NaOH oder HCl, so dass die gewünschten pH (7,4) erreicht wird. Verfolgen Sie alle kleinen Mengen zur Neutralisation hinzugefügt oder entfernt für pH-Test. Sobald die Lösung neutralisiert wurde, fügen 10x PBS auf 1 / 10 werden das Endvolumen (9.1 die aktuelle Lautstärke). Bestimmen Sie die Konzentration der injizierbaren ECM und fügen Sie dann 1x PBS auf die gewünschte endgültige Zusammenarbeit erreichenncentration, hier 6 mg / mL. </li><li> Charakterisierung der injizierbaren ECM können über SDS-PAGE, Blyscan Colorimetric GAG Assay und Massenspektroskopie durchgeführt werden. </li><li> An diesem Punkt kann das Matrixmaterial in vivo injiziert werden, um ein Gerüst für myokardiale Tissue Engineering bilden. </li></ol></li><li> Biotin-Labeling <ol class="lroman"><li> Das ECM kann mit Biotin vor der Injektion zur einfachen Visualisierung der injizierten ECM markiert werden. </li><li> Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von Biotin und fügen Sie die injizierbare ECM bei einem Verhältnis von 0.3mg/mg. Die ECM sollte in der gewünschten Konzentration zur Injektion werden. Sollte das Spritzen in einer Konzentration von 6 mg / mL, dann werden 40 ul Biotin pro 1 ml ECM. Vor der Injektion, halten Sie die Biotin-ECM-Lösung auf Eis für mindestens 1 Stunde. </li></ol></li><li> Alle Bearbeitungsschritte können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Um die injizierbare Matrix aus Geliermittel, kann der pH-Einstellung Schritt auf Eis durchgeführt werden. </li></ol> 3. Myocardial Injektionen <ol class="lalpha"><li> Injection Vorbereitung <ol class="lroman"><li> Für die weiblichen Ratten (225-250 g) verwendet hier wurden 75 uL Injektionen von pH 7,4 injizierbaren ECM in 0,1 ml-Spritzen bestückt mit 30-Gauge-Nadeln vorbereitet. Wenn männliche Ratten (375-400 g) verwendet wurden, konnten 90 &amp;mgr; l injiziert werden. </li><li> Alle chirurgischen Versorgung sollte vor dem Eingriff sterilisiert werden, hier verwenden wir eine autoklaviert chirurgischen Pack, das alle notwendigen Werkzeuge enthält. </li></ol></li><li> Am Tag der Operation, ist eine Harlan Sprague-Dawley Ratten anästhesiert unter Verwendung von 5% Isofluran, intubiert mit einem Otoskop und dann mit 2,5% Isofluran während des gesamten Verfahrens beibehalten. </li><li> Add künstliche Tränenflüssigkeit Salbe auf die Augen des Tieres gegen Trockenheit und Haar zu schützen. Verwalten 3 ml Ringer-Laktat-Lösung für die Hydratation während der Operation. Dies sollte über eine subkutane Injektion in den unteren Bauchbereich durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem OP-Tisch und sanft streifen Gliedmaßen. Verwenden Sie Klipper, um das Haar am Bauch und im Vakuum frei Haar vor dem Waschen entfernen. </li><li> Machen Sie eine Reihe von kleinen Injektionen (etwa 50 ul pro Stück) von 2% Lidocain entlang einer Diagonale von zyphoid Prozess der unteren rechten Seite des Bauches. Dann scheuern dreimal mit betadine, beginnend in der Mitte und nach außen bewegen. Wiederholen Sie mit 70% Ethanol. Decken Sie die Tiere mit ein chirurgisches Abdecktuch mit einem vorgefertigten kreisrundes Fenster, sichere mit Handtuch Klemmen, wenn nötig. </li><li> Mit einem Skalpell Nr. 10 eine 3-4 cm Schnitt von der Schwertfortsatz am unteren rechten Seite des Bauches. Suchen Sie Schwertfortsatz und sezieren senkrecht nach unten durch den Muskel auf der rechten Seite, wobei darauf geachtet, die großen Gefäße auf der rechten Seite zu vermeiden. Sobald Sie durch den Muskel seziert, mit einer Schere geschnitten seitlich durch den Muskel, Freilegung der Membran. Achten Sie darauf, um die Leber zu vermeiden. </li><li> Mit einem 36-Zoll-Länge von 3-0 Vicrile Naht und ein Paar Hämostatika, fahren eine Nadel durch die zyphoid Prozess und ziehen Sie den Faden zur Hälfte. Kleben Sie die Enden der Naht zusammen und befestigen, dass bis zu einem Punkt über und hinter dem Tier im Wesentlichen die Aufhebung des zyphoid und Freilegung der Membran. Mit einem weiteren 36-Zoll-Länge von 3-0 Vicrile Naht, fahren eine Nadel durch den Muskel am nächsten an der Schwertfortsatz und wieder durchziehen und befestigen die Enden zu einem anderen Punkt auf der rechten Seite der OP-Tisch, voll Freilegung der chirurgischen Hohlraum. </li><li> An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein das Herz durch die Membran zu sehen. Mit einem kleinen Paar Ratte Zahn microforceps, greifen die Mitte der Membran, ziehen Sie es in Ihre Richtung heraus und machen einen sehr kleinen Schnitt mit einer stumpfen Schere. Es ist äußerst wichtig, sehr stumpfen Schere benutzen, um zu vermeiden Stossen in die Lunge. Sobald dieses Loch gemacht worden ist, wird die Lunge zurückgezogen, so dass Sie eine 2-3 cm lange Inzision senkrecht zu der durch die Membrane ins Herz zu visualisieren. </li><li> Legen Sie eine 3-Zoll-Q-Tip auf der linken Seite der Kavität in die Lungen drücken aus dem Weg. Verwenden Sie ein Handtuch Haken, um den Q-Tip in Platz zu sichern. Verwenden Sie eine andere Q-Tip auf der rechten Lunge bewegen aus dem Weg, um den Herzbeutel zu finden. Mit einem Paar microforceps und ein Paar große gezackte Pinzetten, durch den Herzbeutel reißen, Freilegung der Herzspitze. Wenn das Tier vorher einen Infarkt Verfahren unterzogen, das Pericardium bereits fehlen. </li><li> Besorgen Sie sich die Herzspitze mit der Ratte Zahn microforceps und injizieren die Flüssigkeit Matrixmaterial ein Drittel des Weges nach oben von der Spitze. Führen Sie die Nadel parallel zur epikardialen Oberfläche und spritzen mit dem abgeschrägten Rand der Nadel auf der linken Seite. Achten Sie darauf, die großen Herzvene zu vermeiden. Warten Sie ein paar Sekunden, bevor Sie die Nadel. Sie sollten eine Aufhellung des Gewebes an der Injektionsstelle zu sehen. </li><li> Clean up Blut in die Kavität und entfernen Sie das Handtuch Klemme und Q-Tipp, hält die rechte Lunge war. Verwenden Sie gebogenen microhemostats und der RatteZahn microforceps um die Membran zu schließen. Machen Sie eine erste Knoten und dann mit dem gezackten Zangen und microhemostats auf die Membran mit einer fortlaufenden Naht und eine konische Nadel zu schließen. Vor dem Schließen vollständig, legen PE160 Saugschlauch und einen 10-ml-Spritze, um den Brustkorb zu evakuieren, als die Naht angezogen wird. </li><li> Wenn sie richtig evakuiert und geschlossen, sollte die Membran konkav sein. Eine konvexe Membran zeigt, dass es noch in den Hohlraum Luft. </li><li> An diesem Punkt der Isofluran kann bis auf 1% gedreht werden. </li><li> Nehmen Sie beide 3-0 Vicrile Nähte halten den Hohlraum offen. Verwenden Sie sterilem Wasser zu Hydrat des Muskels, wischt überschüssiges weg mit einem Q-Tip oder steriler Gaze. Verwenden Sie eine neue Länge von 3-0 Faden auf die Muskelschicht mit Intervallschaltung Nähte schließen. </li><li> An diesem Punkt kann der Isofluran ausgeschaltet werden. </li><li> Den Bereich mit sterilem Wasser und verwenden Sie Klammern, um Haut zu schließen. Wenn Heftklammern mit der Prüfung beeinträchtigen wird, kann 5-0 Prolin Nahtmaterial verwendet werden. In diesem Fall benutzen Sie ein Reverse-Schneiden (RC) Nadel auf der Haut mit Intervallschaltung Nähte schließen. In beiden Fällen vor Ort chirurgische Kleber über den geschlossenen Schnitt. </li><li> Verwenden Sie ein Q-Tip auf die Inzisionsstelle mit einem Triple-antibiotische Salbe salben. </li><li> Lassen Sie das Tier auf unter 100% Sauerstoff zu erholen. </li><li> Wenn die Tiere rund um den Ventilator zu atmen beginnt, entfernen Sie die Luftröhre Röhre. </li><li> Sobald die Tiere sternalen sind, zu verwalten eine subkutane Injektion von 0,05 mg / kg von Buprenorphin-Hydrochlorid und bringt sie zu ihren eigenen Käfig auf einem sterilen Tuch. </li><li> Die Tiere sollten eine postoperative Beobachtung und Pflege. </li><li> Zu der Zeit Points of Interest, werden die Tiere getötet und die Herzen zur Analyse entnommen. Kurze Achse Querschnitte getroffen werden und kann mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) für grobe Gewebe-Analyse gefärbt werden. In kurzer Zeit Punkte, wird der eingespritzte Region als rosa, faserigen Netzwerk, interstitiell ausgebreitet hat erscheinen. Zu späteren Zeitpunkten wird man beobachten, einen Zustrom von Zellen und einem eventuellen Abbau des injizierten Matrix nach 2 bis 3 Wochen. Wenn das ECM wurde mit Biotin vor der Injektion bezeichnet, kann es sein, mehr direkt durch Anfärben der Biotin mit HRP-konjugiertem Streptavidin. Immunhistochemische Färbung kann verwendet werden, um bestimmte Zellen oder Strukturen in der Injektion Region zu identifizieren, hier die Folien wurden mit einem FITC-konjugierten isolectin, die Endothelzellen und fluoresziert grün und ein Anti-smooth muscle actin Antikörper bindet mit einem AlexaFluor sekundären co-gefärbt werden Antikörper, der die SMCs in rot Berichte. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Vorherige Charakterisierung von Matrix-Materialien auf diese Weise hergestellten demonstriert die Retention von einer Vielzahl von Makromolekülen. Konkret wurden mehrere faserige Proteine ​​und Glykoproteine ​​über Massenspektrometrie (Tabelle 1) identifiziert. Wenn die Matrix-Materialien verarbeitet nach diesem Protokoll gefunden werden, nicht mehr enthalten eine komplexe Anordnung von Makromolekülen, könnte es sein, dass die Dezellularisierung verwendete Protokoll zu hart ist. Einmal vollständig lyophilisiert, sieht die getrockneten pericardial ECM wie sehr steif, zerknittertes Papier. Andere Gewebetypen wird ähneln Verpackung Erdnüsse. Wenn gefräst hat, sollte den ECM durch das Sieb fallen und in das Glas am Boden gesammelt werden. Wenn Feuchtigkeit in der Probe wird die ECM verklumpen und in der Mahlkammer stecken. Nach der Verdauung, sollte die ECM-Lösung eine milchige Farbe und völlig frei von sichtbaren Partikeln sein. Es wird auch etwas zäher als die HCl allein. Wenn das ECM nicht gut verdauen, wird es noch große Partikel in der Flasche sein, alternativ das ECM kann abstürzen, aus der Lösung. Nach pH-Einstellung gibt es keine sichtbare Veränderung in der Lösung, und der ECM ist noch eine trübe, homogene Flüssigkeit. Wenn es zu gelieren beginnt, wird die Viskosität zu erhöhen, und es wird schwierig oder unmöglich sein, das Material erarbeiten in eine Spritze. Wenn dies geschieht, führen Sie die pH-Einstellung Schritt auf dem Eis, mit vorgekühlten Lösungen. Nach den Injektionen hergestellt worden sind, halten sie auf dem Eis bis zum Gebrauch. Wenn die Injektion erfolgreich ist, hellt die Region rund um die Nadelspitze und einer kleinen Bolus sichtbar ist. Wird dies nicht beachtet wird, kann die Injektion in die Kammer statt in die Wand gegangen. Wenn Naht das Tier nach der Injektion ist eine sorgfältige Schließen der Membran der wichtigste Schritt. Wenn es richtig gemacht, wird die Membran dicht sein gegen die Lungen und erscheint konkav. Wenn es keine Luft in der Lunge nach links, wird die Membran bleibt konvex oder einen Bereich, wo es Ballons aus. Bei der Prüfung der Histologie der Injektion Region zu einem frühen Zeitpunkt (30 Minuten bis 4 Stunden nach der Injektion), sollte man sehen, eine rosa, faserigen Gebiet, das frei von Zellen ist dies der zusammengesetzt Matrixmaterial nach der Injektion (Abbildung 2) . Das Netzwerk breitet sich oft interstitiell und kann in vielen Bereichen zu präsentieren. Ein evtl.ible Erklärung für das Sehen nur einen sehr kleinen Bereich der Matrix-Gel ist, dass ein Teil der Injektion der intramuralen Ziel verfehlt und war entweder in die LV eingespritzt oder durchgesickert der Injektionsstelle. Darüber hinaus, abhängig von der Gelierzeit, kann die interstitielle Ausbreitung variieren. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Ergebnisse. (A) Molekulargewicht Standard. (B) Rattenschwanz Kollagen Typ I (2,5 mg / mL) im Vergleich zu den gelösten menschlichen (C) und Schweinen (D) pericardial ECM (7 mg / mL). Notieren Sie sich die Anwesenheit von Kollagen sowie mehrere andere Proteine ​​und Peptide in den Herzbeutel Matrix Proben. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. ECM-Komponenten mit Massenspektroskopie identifiziert. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Myocardial Injektionen:. In vivo Gelierung. H &amp; E des menschlichen (A) und Schweine-Färbung (B) pericardial Matrix Injektionen, die in vivo nach 45 Minuten haben geliert. Die Pfeile zeigen Matrix Lage, gebeizt hell-lila, als das Myokard. Scale-Bar ist 500 um. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Vascular-Zell-Infiltration. Fluoreszierende Farbstoffe für Schiffe in der injizierten menschlichen (AC) und Schweinen (DF)-Matrix Gele bei zwei Wochen. Endothelzellen sind grün gekennzeichnete (A, D), während Zellen der glatten Muskulatur rot (B, E) gekennzeichnet sind. Zusammengeführt Bilder sind in C gezeigt und F. Scale-bar ist 100 um. Die weißen gestrichelten Linien zeigen den Bereich der Matrix Injektion, wie von H &amp; E-Analyse von einem nahe gelegenen Abschnitt bestimmt. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Stammzellen innerhalb der Matrix Injektion Region. Ein Hoescht für Kerne Fleck (blau) und c-kit (grün) identifiziert Stammzellen in das menschliche (A) und Schweinen (B)-Matrix Injektion Regionen. Scale-Bar ist 50 pm.

<ol>
	<li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel:+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li><li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix.">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li><li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet.">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li><li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li><li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival,+reduces+infarct+expansion,+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium.">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li><li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li><li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction.">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material.">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li></ol>

Nutzung von Tieren: Alle Versuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of California, San Diego und der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care veröffentlicht durchgeführt.

Diese Methode ermöglicht die Generierung von biologisch abgeleitet, injizierbare Gerüste für myokardiale Tissue Engineering. Obwohl diese Methoden wurden ursprünglich für die Herstellung entwickelt und in vivo Tests eines Myokard-Matrix-Gel und hier mit einem Perikarderguss Matrix-Gel vorgestellt, dieses Protokoll für die Verwendung mit einem beliebigen Gewebe angepasst werden, sofern das Gewebe angemessen sein dezellularisierte. Dezellularisierung sollte durchgeführt werden und vor der Anwendung dieser ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pepsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>p6887-1G</td>
<td>Lyophilized </td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>21217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutravidin-HRP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>21130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equipment: </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiley Mini Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>3383L10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Labconco Lyophilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco, Inc</td>
<td>7670520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products, L.P.</td>
<td>67618-154-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lactated Ringers Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>003966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KY Jelly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>28658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lidocaine, 2%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>17767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.</td>
<td>12496-0757-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Artificial tear ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>NC9860843</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triple antibiotic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19082795</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>60307-120-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Otoscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>008699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stop cock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>006245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-0 Vicrile suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>J327H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 Proline suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>s-1173</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reverse cutting (RC) needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8684G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microhemostats </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>13013-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat tooth microforceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11084-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>No. 10 scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10110-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blunt scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14108-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp, curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large, serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>1106-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE160 suction tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427430 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clippers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>21608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin staples/stapler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>PRR35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>General supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stir plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 M HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 M NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 mL syringes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Q-tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical drape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Towel clamps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small hand-held vacuum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of biologically derived injectable materials for myocardial tissue engineering

Dieses Protokoll bietet Methoden für die Herstellung eines injizierbaren extrazellulären Matrix (ECM)-Gel für myokardiale Tissue Engineering-Anwendungen. Kurz gesagt, ist dezellularisierte Gewebe lyophilisiert, gefräst, enzymatisch verdaut und anschließend auf physiologischen pH-Wert gebracht. Die Gefriertrocknung entfernt alle Wassergehalt aus dem Gewebe, was zu trockenen ECM, die in ein feines Pulver mit einer kleinen Mühle gemahlen werden. Nach dem Mahlen wird die ECM-Pulver mit Pepsin verdaut, um eine injizierbare Form einer Matrix. Nach Einstellung auf pH 7,4, kann die Flüssigkeit Matrix-Material in den Herzmuskel injiziert werden. Die Ergebnisse der bisherigen Charakterisierung Tests haben gezeigt, dass Matrix Gele aus dezellularisierte Perikarderguss und Herzmuskelgewebe produziert nativen ECM-Komponenten, darunter verschiedene Proteine, Peptide und Glykosaminoglykanen behalten. Bei der Verwendung dieses Materials für das Tissue Engineering, in vivo Charakterisierung ist besonders nützlich, hier ein Verfahren zur Durchführung eines intramuralen Injektion in den linken Ventrikel (LV) frei an der Wand wird als Mittel zur Analyse der Host-Reaktion auf die Matrix-Gel in vorgestellt ein kleines Tier-Modell. Der Zugang zu den Brustraum wird durch die Membran gewonnen und die Injektion ist leicht über die Spitze in der LV freien Wand gemacht. Die biologisch abgeleiteten Gerüst visualisiert werden durch Biotin-Markierung vor der Injektion und dann Färbung Gewebeschnitte mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Neutravidin und Visualisieren über Diaminobenzidin (DAB) Färbung. Die Analyse der Injektion Region kann auch mit histologischen und immunhistochemischen Färbung durchgeführt werden. Auf diese Weise wurden die bisher untersuchten Herzbeutel und Herzmuskel-Matrix-Gelen gezeigt, faserige, poröse Netzwerke zu bilden und zu fördern Gefäßbildung innerhalb der Injektion Region.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering at JoVE.com

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Matrix-Gel aus dezellularisierte Gewebe und Injektion in Ratten-Myokard<em&gt; In vivo</em&gt; Beschrieben sind.

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

fabrication-biologically-derived-injectable-materials-for-myocardial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Aufrufe.  University of California, San Diego. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Matrix-Gel aus dezellularisierte Gewebe und Injektion in Ratten-Myokard In vivo Beschrieben sind.

Serie: Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Forschung

Biotechnik

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Herstellung von mechanisch Tunable und Bioactive Metallgerüste für biomedizinische Anwendungen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...